【分享】定量PCR 选择：荧光探针与荧光引物

要提到荧光探针或者荧光引物，有一个基础概念需要首先明确，那就是荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)：一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体 (donor) 和能量受体 (acceptor) 对, 其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，当它们在空间上相互接近到一定距离(1—10 nm)时，激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。能量传递的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等有关。定量PCR所涉及的荧光探针和荧光引物的检测都这个FRET原理相关。

实时荧光PCR中另一个很重要的概念，即Ct值.C代表循环(Cycle)，T代表阈值(Threshold).Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数.。一般取PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线.因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

一：水解探针法
TaqMan技术
原理：除了一对特异性引物，TaqMan探针法增加一条和模版互补的基因特异性探针（通常20—30bp），探针上5'端和3'端分别标记了一个报告荧光基团（供体）和一个淬灭荧光基团（受体），在反应初始（探针完整）时系统激发供体而产生的荧光信号被临近的淬灭基团吸收，所以此时检测不到供体荧光信号；而当PCR过程中Taq DNA聚合酶扩增到探针结合模版的位点时，其5'-3'核酸外切酶的活性（也就是切口平移）切割掉探针5'端的报告基团——游离的报告基团远离淬灭基团，打破能量的传递，激发报告基团产生的荧光信号就可以被荧光检测系统检测到。这样每扩增一条DNA链，就对应有一个游离的荧光分子（报告基团）形成，保证了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，因此对荧光信号进行检测就可以实时监控PCR的过程，准确定量PCR的起始拷贝数。但是实际上探针较长使得两端基团距离较远，会导致荧光淬灭不彻底，而且淬灭基团也会产生不同波长的荧光，都会使得本底偏高

MGB技术
原理：针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题，2000年美国ABI公司推出了一种新TaqMan探针——MGB探针（minor groove binder oligodeoxynucleotide conjugate, MGB-ODN)，3'端采用了非荧光性的淬灭基因——淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。此外，MGB探针的3'端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽( dehydrocyclopyrroindole tripetide, DPI3)， 可以大大稳定探针与模板的杂交, 升高探针Tm 值, 使较短的探针同样能达到较高的Tm 值——而短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近, 淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高： 一个15bp的MGB 探针的信噪比大于6,优于理想状态下的25bp的普通Taqman探针（信噪比约为1.5）。允许采用更短的探针也简化了探针的设计和成本。有实验证明MGB探针对于等位基因的区分比较理想，甚至可以检测单碱基突变(因为碱基错配对较短探针的杂交稳定性影响更大) 。

水解探针之所以称之为水解，主要是因为它利用的是Taq酶的水解作用，使得探针上的荧光报告基团远离淬灭基团而发光信号，游离的报告基团数目对应PCR新扩增产物，此方法检测的是积累荧光。

优点：

灵敏，特异性高：具有模版序列特异的Taqman探针在引物特异的基础上进一步提高的定量PCR的专一性；每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，仪器检测的是特异扩增的结果，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性。

有多种不同波长的荧光基团对可供选择，使得Taqman探针法可以实现在同一管内检测多重PCR，降低成本也提高效率和准确性

避免了荧光染料对PCR反应的影响

应用：Taqman技术广泛应用在人类传染病诊断和病原定量上，在动物疾病病原体基因的检测、畜禽产品的检验检疫、生物制品的鉴定以及在疫苗效力测定上等方面都有成功的许多例子。

注意：1) 探针长度应在15-45bp（最佳20-30bp)左右，以保证结合的特异性。2) GC碱基含量在40%-60% ，避免单核苷酸序列的重复。3)避免与引物发生杂交或重叠。 4)探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度,因此探针的Tm值要比引物的Tm 值至少高出5℃。另外，探针的浓度，探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。另外，在仪器的选择上也要注意，尽量选择具有4色或以上的荧光检测通道的仪器，已保证你的机器的适用性和试剂选择的灵活性。毕竟技术是在快速发展的。

缺点：探针设计有一定难度，需要验证效果，探针的合成和双荧光标记成本高

此外，也有人认为，Taqman法利用了Taq酶的外切活性，而由于各家公司出产的Taq酶对于其外切酶活性并没有做出严格的活性标定，定量PCR的效率有可能受酶外切活性的影响，酶活性差异也给定量带来了不确定性。至少，生物通定量PCR技术系列前面介绍的Stratagene 2100万美元专利之争的Fullvelocity DNA聚合酶由于去掉外切酶活性，就不能用于Taqman探针法了！

二：杂交探针法
FRET技术
原理：罗氏专利的FRET探针又称为双杂交探针，或者LightCycle探针。FRET探针由两条和模版互补、且相邻的特异探针组成（距离1—5bp），上游探针的3`端标记供体荧光基团，相邻下游探针的5`端标记Red 640受体荧光基团。当复性时，两探针同时结合在模板上，供体基团和Red640受体基团紧密相邻（距离1—5bp），激发供体产生的荧光能量被Red640基团吸收，使得检测探头可以检测到Red640发出波长为640的荧光。当变性时，两探针游离，两基团距离远，不能检测到640波长的荧光。FRET探针检测的信号是退火时的实时信号，每次检测信号始终严格对应模版的数量，非累积信号，可以用于做Tm曲线和SNP检测。常用的受体荧光基团除了LC-Red640还有LC-Red705。 两个单标记探针的长短不影响信号的传递，而探针间的距离通常为1-5bp（虽然越短越好，还是要留点空间避免相互之间的反应）。

Taqman水解探针法中，一但报告基团水解离开淬灭基团，就一直游离于反应体系中可被检测，所以检测的是累积荧光，是不可逆的。杂交探针不同，是复性时两条特异探针杂交到模板上，相互靠近而产生检测信号，到升温变性探针远离模版就没有信号，所以检测的是实时信号，是可逆的，所以可以进行熔解曲线的分析，还可以用于进行突变分析，SNP基因分型以及产物鉴别。比如一旦探针位置上出现有点突变，通过熔解曲线就可以很快分析出来，这也是Taqman法无法做到的。另外，由于采用2条模版特异的探针，杂交探针法的专一性无疑更高于其他方法，不受非特异产物的影响。

Fret探针法由于需要合成2条探针，探针的末端要封闭以避免反应，所以合成的成本会比较高，也比较麻烦。但实际上，Fret探针的设计其实比Taqman探针容易，因为Taqman探针要求一定的长度以保证探针的特异性和结合模版的能力，但是长度会导致两末端的荧光基团距离远而使得荧光共振能量传递的效率降低，淬灭不彻底。Fret探针就不受这个限制。不管怎么说，多数人还是习惯认为单探针比合成2条探针要简单。

在水解和杂交探针技术之间产生另外一种技术：分子信标（分子信标产生时间是1996年）