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第1楼2010/10/21
【品牌】
什么东西都有品牌,现在国内国外PCR仪的品牌很多,就国外而言比较著名的有:
ABI美国应用生物公司:老牌的生物公司贵族,其收购了原来的PE,而PE公司是PCR的鼻祖,旗下有很多经典的PCR仪,有5700(已停产)、7700(已停产)、7000、7900等实时荧光定量PCR仪。
ROCHE罗氏诊断:炙手可热的新贵,LIGHTCYCLER是其唯一的PCR仪,市场做得很不错,以科研定位为主,但在国内很多医院使用,其很特色离心、气加热、毛细管等,设计另类,是最有特色的PCR仪,当然好坏另议,就单其另辟蹊径的技术能力和胆识就值的佩服。
MJ:刚入中国的名流,MJ的扩增仪在生命科研领域比较出名,其产品比较适合高通量检测,人类基因组计划用得很多。其实时荧光PCR仪刚进入中国不久,孔间能使用不同温度是其特色。这点其实比较有用。
伯乐:呵,廉价的麦当劳,ICYCLER是其主打,进入中国已经比较久了,产品和5700一样,是扩增仪上加装定量模块而成,特点是价格较低。
国内现在做的也很多,比如杭州博日、杭州朗基、上海枫岭、厦门安普利等。
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第2楼2010/10/21
【选购】
准确的讲包括实时荧光定量在内都没有自动加样和标本处理系统,只能算半自动的。PCR仪是个简单的东东,一个温控设备和一个检测设备而已。
关于温控,主要是介质问题。理想的介质是导热性好、比热大、接触紧密的东东。
这方面最好的是水浴和油浴,比热大(油比水更大)、溶剂化物体,与反应物无缝接触,效果当然最好。但是自动化,小型化难,只有最初的水浴锅式使用。
硅加热,这是使用最普遍的一种,优点:易自动化、速度快、直接加热降温,效果当然好,但是第一成本较高,第二其使用的介质是金属,导热虽然好,但是与反应管,很难做到无缝接触,定性时代可以加油,但用荧光定最,由于油有荧光信号不能用。所以在无缝接触上差一些。第三由于是底部加热,下部压力较大,有溢出的可能,不过新的仪器在加热盖以后解决了这个问题。
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第3楼2010/10/21
空气加热,用空气做介质有优点,与反应体系无缝接触,但是空气的导热性差、比热小的弱点明显。因此空气加热的要利用离心来产生空气流动,增强导热性,同时使用毛细管,加大接触面积、试剂微量化来弥补。这样做了以后效果还是不错。但有的厂商把什么离心、毛细管的好处大讲特讲,对气加热的弱点闭口不谈,却是高明的市场手法。同时,使用离心,对标本量增大是有影响的并且标本量越大,空气比热小的弱点就越明显,所以空所加热的仪器标本量都比较小。使用毛细管后由于反应液与管的接触面积增大,吸附现象更大,因此试剂的通用性差一般要专门开发,成本高,虽然试剂用量少,但因为是专用试剂,每人份就是以实际量算,并不省试剂。反而增加了毛细管成本。
关于功能,所有的PCR仪功能都大体相同。只有MJ孔间能使用不同温度比较独特,这对于多项目同时检测以及循环参数的调整比较有用。但其实时荧光的仪器刚进入中国不久,具体如何还不得而知。
关于选购,根据单位情况而定,由于PCR的技术含量其实并不高,好的国产仪器如杭州博日(与日本著名厂商大和有关)也差不太多。关于进口仪器,罗氏的仪器不错,但如果标本量大,建议不要用罗氏。一则会累死的。另外,每个标本要分摊的标准曲线、对照成本太高。同时,试剂也比较受限。
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第5楼2010/10/21
2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅
*最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系
*与反应起始时RNA的总量及纯度有关
*建议在试验中加入对照RNA
*第一链的反应产物在进行PCR扩增时,在总的反应体系中的含量不要超过1/10
*建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物(GSP)用于第一链合成。由于RNA模板存在二级结构,如环状结果,有可能导致GSP无法与模板退火;或SSⅡ反转录酶无法从此引物进行有效延伸。
*目的mRNA中含有强的转录中止位点,可以试用以下方法解决:
a. 将第一链的反应温度提高至50℃。
b. 使用随机六聚体代替Oligo(dT)进行第一链反应。