【资料】PCR知识分享

【品牌】

　　什么东西都有品牌，现在国内国外PCR仪的品牌很多，就国外而言比较著名的有：

　　ABI美国应用生物公司：老牌的生物公司贵族，其收购了原来的PE，而PE公司是PCR的鼻祖，旗下有很多经典的PCR仪，有5700（已停产）、7700（已停产）、7000、7900等实时荧光定量PCR仪。

　　ROCHE罗氏诊断：炙手可热的新贵，LIGHTCYCLER是其唯一的PCR仪，市场做得很不错，以科研定位为主，但在国内很多医院使用，其很特色离心、气加热、毛细管等，设计另类，是最有特色的PCR仪，当然好坏另议，就单其另辟蹊径的技术能力和胆识就值的佩服。


　　MJ：刚入中国的名流，MJ的扩增仪在生命科研领域比较出名，其产品比较适合高通量检测，人类基因组计划用得很多。其实时荧光PCR仪刚进入中国不久，孔间能使用不同温度是其特色。这点其实比较有用。

　　伯乐：呵，廉价的麦当劳，ICYCLER是其主打，进入中国已经比较久了，产品和5700一样，是扩增仪上加装定量模块而成，特点是价格较低。

　　国内现在做的也很多，比如杭州博日、杭州朗基、上海枫岭、厦门安普利等。

【选购】

　　准确的讲包括实时荧光定量在内都没有自动加样和标本处理系统，只能算半自动的。PCR仪是个简单的东东，一个温控设备和一个检测设备而已。

　　关于温控，主要是介质问题。理想的介质是导热性好、比热大、接触紧密的东东。

　　这方面最好的是水浴和油浴，比热大（油比水更大）、溶剂化物体，与反应物无缝接触，效果当然最好。但是自动化，小型化难，只有最初的水浴锅式使用。

　　硅加热，这是使用最普遍的一种，优点：易自动化、速度快、直接加热降温，效果当然好，但是第一成本较高，第二其使用的介质是金属，导热虽然好，但是与反应管，很难做到无缝接触，定性时代可以加油，但用荧光定最，由于油有荧光信号不能用。所以在无缝接触上差一些。第三由于是底部加热，下部压力较大，有溢出的可能，不过新的仪器在加热盖以后解决了这个问题。

空气加热，用空气做介质有优点，与反应体系无缝接触，但是空气的导热性差、比热小的弱点明显。因此空气加热的要利用离心来产生空气流动，增强导热性，同时使用毛细管，加大接触面积、试剂微量化来弥补。这样做了以后效果还是不错。但有的厂商把什么离心、毛细管的好处大讲特讲，对气加热的弱点闭口不谈，却是高明的市场手法。同时，使用离心，对标本量增大是有影响的并且标本量越大，空气比热小的弱点就越明显，所以空所加热的仪器标本量都比较小。使用毛细管后由于反应液与管的接触面积增大，吸附现象更大，因此试剂的通用性差一般要专门开发，成本高，虽然试剂用量少，但因为是专用试剂，每人份就是以实际量算，并不省试剂。反而增加了毛细管成本。

　　关于功能，所有的PCR仪功能都大体相同。只有MJ孔间能使用不同温度比较独特，这对于多项目同时检测以及循环参数的调整比较有用。但其实时荧光的仪器刚进入中国不久，具体如何还不得而知。

　　关于选购，根据单位情况而定，由于PCR的技术含量其实并不高，好的国产仪器如杭州博日（与日本著名厂商大和有关）也差不太多。关于进口仪器，罗氏的仪器不错，但如果标本量大，建议不要用罗氏。一则会累死的。另外，每个标本要分摊的标准曲线、对照成本太高。同时，试剂也比较受限。

PCR仪常见问题及回答
1. cDNA产量的很低
可能的原因：
*RNA模板质量低
*对mRNA浓度估计过高
*反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足
*同位素磷32过期
*反应体积过大，不应超过50μl

2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅
*最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系
*与反应起始时RNA的总量及纯度有关
*建议在试验中加入对照RNA
*第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10
*建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物（GSP）用于第一链合成。由于RNA模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GSP无法与模板退火；或SSⅡ反转录酶无法从此引物进行有效延伸。
*目的mRNA中含有强的转录中止位点，可以试用以下方法解决：
a. 将第一链的反应温度提高至50℃。
b. 使用随机六聚体代替Oligo(dT)进行第一链反应。

3. 产生非特异性条带
*用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样条带，则需要用DNase I重新处理样品。
*在PCR反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物Tm 2至5℃的温度下进行退火，降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。
*由于mRNA剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-PCR结果。

4. 产生弥散（smear）条带
*在PCR反应体系中第一链产物的含量过高
*减少引物的用量
*优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数
*在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。

5. 产生大分子量的弥散条带
*大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的
*对于长片段的PCR，建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10（或1:100-1:200）

6. 在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果
*通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致的。由于进行体外转录时不可能将所有的DNA模板消除。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影响。
*有可能是引物二聚体的条带