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【资料】高速逆流色谱介绍---工作步骤

jia

2010/10/27

高速逆流色谱的工作步骤

1、溶剂系统的准备

溶剂系统通常要在使用前配制，并要给予充分的时间来使两相溶剂达到的平衡。否则，在运行过程容易产生气泡。溶剂系统最好在使用前再把两相分开，由于不同溶剂的蒸气压的不同，溶剂的蒸发会引起溶剂比例的变化，所以，已经分开的溶剂系统的上、下相要放置于密闭的容器储存。

2、柱系统的运行
在仪器不旋转的状态下，通常以较高流速将固定相泵入螺旋管柱内。然后按照设定的仪器转向（正转或反转），调节转速，使之达到设定的速度，开启溶剂泵的开关，以一定的流速泵入流动相。当溶剂体系建立了流体动力学平衡时，即流动相从管柱的尾端清晰的流出时，整个仪器系统稳定后，即可进行下一步的进样操作。应该指出，在快速泵入固定相时，让仪器作选定转动方向的反向的慢转（例如每分钟几十转），能够有效地排除螺旋管柱内的气体，更好地保证分离工作的效果。

3、样品溶液的制备和进样

逆流色谱样品溶液的制备，通常是用上、下相的混合溶液来溶解样品。当样品量比较少时，可用上下相任何一相来溶解；当样品量比较多时，通常要用适量等体积的上、下相混合溶液来溶解。过高的浓度的样品溶液进入分离柱时，有时会形成“样品栓”，会把整个固定相推出分离柱。在这种情况下，只能采取稀释样品的办法来解决。大体积的进样量，通常会使峰带变宽，固定相会出现流失。在这种情况下，可采用降低流速的办法来改善这一缺陷。

4、HSCCC分离和检测

在上述进样后，进入HSCCC分离的过程，利用检测器监测得到逆流色谱峰形图，利用馏分收集器或手动收集法收集被分离后的相应于各色谱峰的馏分。

在HSCCC操作中除了正常的洗脱方式外，还能采用步级式洗脱和梯度洗脱^[17~21]。不论采用何种洗脱方法，在这种分离实验中，采用首到尾端的洗脱方式总能给出较好的分离结果。对于某些溶剂系统来说，尾到首端的洗脱方式会导致一定的固定相流失，从而使峰形分辨度降低。尽管这种流失不严重和对分离结果影响不大，但是，流失的固定相水滴会被吸附在检测器的流通池壁上，形成对于溶质吸收峰的“噪音”干扰。

5、清洗分离柱

当HSCCC一次分离完成时，可以利用氮气瓶或者空气压缩机将分离柱中的液体吹出，并收集这些排出液体，并测定固定相的保留率[R=（V_总-V_下测）/V_总]。同时注意，吹出的固定相中可能会含有有用的成分，这些成分是对固定相有极强亲和力的成分，不能轻易扔掉。吹出柱内溶剂的分离柱要用乙醇清洗一次，如果应用了酸碱或缓冲盐溶液要首先用蒸馏水冲洗，然后再用乙醇冲洗，以避免残留物对下次分离工作的干扰和影响。

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阿三

第1楼2010/10/27

谢谢楼主分享。

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