【分享】生化实验的基本操作和常用仪器使用

（二）沉淀的过滤和洗涤
1. 过滤沉淀一般使用滤纸。
2.应根据沉淀的性质选择不同的滤纸.胶状沉淀,应使用质松孔大的滤纸.一般大小颗粒的结晶形成沉淀,应使用致密孔小的滤纸。而极细的沉淀，则应使用致密孔最小的滤纸。滤纸越致密，过滤就越慢。
3.滤纸的大小要由沉淀量来决定，并不是由溶液的体积来决定。沉淀量应装到滤纸高度的1／3左右。最多不应超过1／2，通常使用直径为7-9厘米的圆形滤纸。
4.折叠滤纸应先整齐的对折，错开一点再对折，打开后形成一边一层，一边三层的圆锥体。折叠尖端时不可过于用力，以免容易出洞。放入漏斗中时，滤纸边缘应完全吻合。撕去三层一边的外面两层部分的尖端，使滤纸上缘能更好的贴在漏斗的壁上，不留缝隙。而下面部分则有空隙以利于提高过滤速度。
5.滤纸上缘一般应低于漏斗口上周0.5至1厘米。润湿滤纸时应用指尖轻压滤纸赶净滤纸和漏斗间的气泡，使滤纸紧贴漏斗壁。同时漏斗颈内必须充满液体，这样，才可籍液体的重量而对于待液体产生吸滤作用。
6.过渡时，为了防止沉淀堵塞滤纸的孔洞，通常采用倾泄法，即先小心的把溶液倾入漏斗而不使沉淀流入，只在过滤的最后一步才把沉淀转移到漏斗上。
7.过滤时，将玻璃棒直立在三层滤纸的中间部分，其下端接近但不能触及滤纸，并使盛器紧贴玻棒，使液体顺玻棒缓缓流入漏斗。液体最多加到距滤纸上缘3-4毫米处，过多则沉淀会因滤纸的毛细管作用而爬到漏斗壁上去。
8. 在容器中洗涤沉淀一般采用倾注法。洗涤时，采取少量多次的方法最为有效。通常，容易洗涤的粗粒晶形沉淀洗 2—3次，难洗涤的粘稠无定形沉淀则需洗 5—6次。注意，每次都应尽量倾以增加洗涤效率，并防止沉淀流失。
9.转移沉淀时，先向沉淀中加入滤纸一次所能容纳量的洗涤液，搅拌成为混悬液，不要等待沉淀下沉，立即按倾注清液的同样方式倾入漏斗。容器内剩余的沉淀可以用少量洗涤液按上述方法重复数次，直到全部转移到漏斗内。
10.在漏斗内洗涤沉淀时，先将沉淀轻轻摊开在漏斗下部，再用滴管（或洗瓶）将洗涤液加入到漏斗上缘稍下的地方，同时转动漏斗，并使洗涤液沿着漏斗不断向下移动，直到洗涤液充满滤纸一半时立即停止。待漏斗中洗涤液完全漏出后，再进行第二次洗涤。通常，完全洗去沉淀所吸附的不择发物质，约需8—10次左右。确知沉淀已经洗净，需要进行必要的检验。必须注意，沉淀的过滤和洗涤工作一定要一次完成，不可间断。

（三）烘箱和恒温箱的使用
烘箱又叫干燥箱，常用的是电热鼓风干燥箱。干燥箱用于物品之干燥和干热灭菌，工作温度为50—250℃。恒温箱又叫培养箱，用于细菌、生物培养等，工作温度自室温以上至60℃。这两种仪器工作原理、结构及使用方法相似。
1.使用方法：
（1）检查温度计是否插入座内，应插在放气调节器中部的小孔内。
（2）把电源插头插好，合上电闸。
（3）将电热丝分组开关的旋钮拨到（l）或（2）（视需要的温度而定），再将自动恒温控制旋扭沿顺时针方向旋转，指示灯红灯亮表示电热丝开始加热。此时也可开鼓风机帮助箱内热空气对流。
（4）在恒温过程中，应注意观察温度计。待温度将要达到需要温度值（差2—3℃）时，使指示灯绿灯正好发亮，此时表示电热丝停止加热，箱内温度即能自动控制在所需要的温度（±0.5℃）。
（5）恒温过程中，如不需要多组电热丝同时加热时，应将电热丝分组开关的旋钮拨到（1）档。
（6）工作一定时间后需要将潮气排出，可打开放气调节器，也可打开鼓风机。
（7）使用完后，关闭鼓风机马达开关，将电热丝分组开关旋钮和自动恒温控制旋扭沿反时针方向施回至零位。
（8）断开电闸，将电源插头拨出插座。

2.注意事项：
（1）使用前应检查电源（电压、电流）是否符合规定，地线是否接妥。
（2）挥发性物品，如盛有有机溶剂的器皿，不能放入，以防火灾和爆炸。
（3）安放物品时，应小心，不要触及自动恒温控制器的窗筒和温度计，以免损坏部件。安放物品后应立即关好箱门，以便保持温度恒定。
（4）烘烤洗刷完的仪器时，应尽量将水珠甩去再放人烘箱内。干燥后，待温度降至60℃以下方可取出物品。注意，若温度超过 180℃，箱内棉花或纸张则烤焦，玻璃器皿则易破损。
（5）电热鼓风干燥箱的电动机轴承，每年至少加润滑油一次。
（6）仪器必须有良好地线．
（7）仪器附近不能放置易燃物品。’
（8）检修时不能带电操作。

（四）电动离心机
在实验过程中，欲使沉淀与母液分开，有过滤和离心两种方法。在下述情况下，使用离心方法较为合适。
（1）沉淀有粘性。
（2）沉淀颗粒小，容易透过滤纸。
（3）沉淀量过多而疏松。
（4）沉淀量很少，需要定量测定。
（5）母液粘调。
（6）母液量很少，分离时应减少损失。。
（7）沉淀和母液必须迅速分离开。
（8）一般肢体溶液。
离心机是利用离心力对混合溶液进行分离和沉淀的一种专用仪器。电动离心机通常分为大、中、小三种类型。在此只介绍生物化学实验室使用的小型台式或落地式电动离心机。
1.操作：
（1） 使用前应先检查变速旋钮是否在“0”处。外套管应完整不漏，外套管底部需放有橡皮垫。
（2） 离心时先将待离心的物质转移到大小合适的离心管内，盛量不宜过多（占管的2／3体积），以免溢出。将此离心管放入外套管，再在离心管与外套管间加入缓冲用水。
（3） 一对外套管（连同离心管）放在台称上平衡，如不平衡，可调整离心管内容物的量或缓冲用水的量。每次离心操作，都必须严格遵守平衡的要求，否则将会损坏离心机部件，甚至造成严重事故，应该十分警惕。
（4） 将以上两个平衡好的套管，按对称方向放到离心机中，盖严离心机盖，并把不用的离心套管取出。
（5）开动时，先开电门，然后慢慢拨动旋钮，使速度逐渐增加。停止时，先将旋钮拨动到“0”，不继续使用时拔下插头，待离心机自动停止后，才能打开离心机盖并取出样品，绝对不能用手阻止离心机转动。
（6）用完后，将套管中的橡皮垫洗净，保管好。冲洗外套管，倒立放置使其干燥。
2.注意事项：
（1）离心过程中，若听到特殊响声，表明离心管可能破碎，应立即停止离心。如果管已破碎，将玻璃渣冲洗干净（玻璃渣不能倒入下水道），然后换新管按上述操作重新离心。若管来破碎，也需要重新平衡后再离心。
（2）有机溶剂和酚等会腐蚀塑料套管，盐溶液会腐蚀金属套管。若有渗漏现象，必须及时擦洗干净漏出的溶液，并更换套管。
（3）避免连续使用时间过长。一般大离心机用40分钟休息20或30分钟，台式小离心机用40分钟休息10分钟。
（4）电源电压应与离心机所需要的电压一致。接地线后，才能通电使用。
（5）一年应检查一次离心机内电动机的电刷与整流子磨损情况，严重时更换电刷或轴承。

（五）分光光度计
根据物质的吸收光谱进行定性或定量分析的方法称为吸收光谱法，或分光光度法。该法所用的仪器称为分光光度计，或吸收光谱仪。如：用于可见光及紫外光区域的吸收光谱仪，通常叫做分光光度计；用于红外光区域的吸收光谱仪，简称为红外光谱仪。
分光光度计的工作原理与光电比色计相似，两者的主要区别在于：首先，分光光度计的单色光器（通过棱镜或光栅）比滤光片所选择的波长范围要小的多。前者为3—5毫微米，是较纯的单色光，而后者为30—50毫微米。其次，分光光度计不仅能在可见光区域内测定有色物质的吸收光谱，而且也能在紫外及红外光区域测定无色物质的吸收光谱。多数情况下，样品不需要显色就能进行定性和定量分析。另外，微电流检流计也比较精密。如：581－G型的灵敏度为0.5×10^-8安培／格， 72型分光光度计为 1.4—2.0×10^-9安培/格。分光光度计还增加了稳压装置。因此，分光光度法优越于光电比色法。在此着重介绍国产72型分光光度计和751型分光光度计的使用。

1、72型分光光度:72型分光光度计是可见光分光光度计，其波长范围为420—720毫微米。
（1）操作方法：
① 按照接线要求，将稳压器和检流计连接在单色器上。注意，将检流计与单色器相接时，应按三股接线的颜色准确连接。而稳压器的输出接线柱与单色器相接。
② 在电源电压与仪器要求的电压相符时，分别插上稳压器和检流计的电源插头。
③ 将单色器的光路闸门找到黑点（关闭光路的指示）位置后，再将检流计上的电源开关旋到“开”处。此时，指示光点即出现在标尺上，用零点调节器将光点中线准确地调至透光率标尺的。“0”位上。
④ 打开稳压器的电源开关和单色器的光源开关，隔10分钟，再使用仪器。
⑤ 将比色杯架暗厢盖打开，取出比色杯架，将4支比色杯中的1支装入空白溶液或蒸馏水，其余3支装入待测液。将比色杯置于架上，空白溶液杯应放在第一格内，放回暗厢内，盖好暗厢盖。此时，空白溶液杯应在光路上。
⑥ 旋转波长调节器，将所需波长对准红线。把光路闸门拨到红点（打开光路的指示）位置上，并以顺时针方向旋动光点调节器，使光点中线移至透光率“100”的刻度处。数分钟后，待光电池趋于稳定，再轻轻转动光点调节器，使光点中线准确地处于透光率“100”的位置。
⑦ 将单色器的光路闸门拨回黑点处，校正检流计的光点中线于“0”位上。然后，立即开启光路闸门，拨至红点处，校正检流计光点中线对准透光率“100”刻度上。
⑧ 调节好后，可以进行样品溶液的测定。将比色杯定位装置的拉杆轻轻地拉出一格，使第二个比色杯内的待测液进人光路。此时，检流计标尺上光点中心线所指示的读教，即为该溶液的光密度或透光率。依此测定第二、第三个待测液，并读出数据。重复2—3次后，取其平均值。
⑨ 在测定过程中，应经常关闭光路闸门，核对检流计的零点位置。如有改变，及时用零点调节器核准。
⑩ 测定完毕，将每个旋钮、开关和调节器等复原或关闭。拔掉电源插头，切断电源，并盖好仪器罩。

（2）注意事项：
① 仪器连续使用时间不应超过2小时，每次使用后需要间歇半小时以上才能再用。
② 测定某未知待测液时，先制作该溶液的吸收光谱曲线，再选择最大吸收峰的波长作为测定的波长。每次读教后将空白杯推入光路，检流计光点中线仍位于透光率 “100”，则读数有效。
③ 其他注意事项与光电比色计相同。
2、751型分光光度计：751型分光光度计是可见光和紫外光分光光度计，其波长范围为200—1000毫微米。
（1）操作方法：
① 在电源电压与仪器要求的电压相符时，插上电源插头。
② 仪器装有两个光源灯。钨灯的波长范围为320—1000毫微米，氢灯为320毫微米以下。拨动光源灯座的把手，将选用的光源灯置于光路中。根据需要可以在光路中插入滤光片，以减少杂散光，一般情况下无此必要。
③ 检查仪器各种开关和旋钮，处于关闭位置时，打开电源开关，预热20分钟。
④ 选择适当的比色杯，测定波长在350毫微米以上时，用玻璃比色杯；若在350毫微米以下，必须使用石英比色杯。比色杯盛入溶液后，放在比色杯架上，然后再放人暗厢内，盖好盖板。此时，空白溶液或蒸馏水的比色杯恰好处于光路中。
⑤ 选择适当的光电管。测定的波长范围在200—626毫微米内，用蓝敏光电管，应将手柄推入：若在625—1000毫微米范围以内，用红敏光电管，应将手柄拉出。
⑥ 将选择开关扳至“校正”位置后，转动选择波长的旋钮，使波长刻度对准所需要的波长。
⑦ 调节暗电流旋钮，使电表指针对准“0”位置。为了得到较高的准确度．每测量一次都应校正暗电流一次。
⑧ 调节灵敏度旋钮，在正常情况下，从关闭的位置起沿顺时针方向转动3—5圈。
⑨ 转动读数电位器旋钮，使刻度盘处于透光率100%位置。然后，把选择开关扳至“ ×1”位置。再拉开暗电流闸门，使单色光进人光电管。
⑩ 调节狭缝旋钮，使电表指针处于“0”位置附近，再用灵敏度旋钮仔细调节，使电表指针准确地位于“0”’处。
⑾完成上述操作后将比色杯定位装置的手柄轻轻地拉出一格，使第二个比色杯的待测液处于光路中。注意，应使滑动板准确地位于定位槽内。这时电表指针偏离“0”位。再转动读数电位器旋钮，重新使电表指针对准“0”位，刻度盘上的读数即为该待测液的光密度或透光率。依此测定第二、第三个待测液，并读出数据。
⑿ 完成一次测量后，立即关上暗电流闸门，以保护光电管。
⒀ 在读数时，若选择开关处于“×1”位置，光密度（即消光）范围为0—∞，透光率是O－100%。当透光率小于10%时，则可把选择开关扳至“× 0.1”位置。这时，读出的透光率数值，应除以“10”；而读出的光密度值，则应加上“1．0”。
⒁ 测定完毕，将每个开关、旋钮、操作手柄等复原或关闭。拔掉电源插头，以切断电源，并盖好仪器罩。
（2）注意事项；
① 该仪器为贵重的精密仪器，应由专人负责管理和维护。
② 若外电路电压波动较大，可使用稳压器，以增加仪器的稳定性。
③ 其它注意事项与72型分光光度计相同