去年冬天
第1楼2011/05/09
供试品溶液的制备 将供试品按标示量溶解后,用测定培养液稀释成每1ml约含1000IU。在96孔细胞培养板中,做4倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2个孔。在无菌条件下操作。
测定法 使WISH细胞在培养基中贴壁生长。按1︰2~1︰4传代,每周2~3次,于完全培养液中生长。取培养的细胞弃去培养液,用PBS洗2次后消化和收集细胞,用完全培养液配制成每1ml含2.5×105~3.5×105个细胞的细胞悬液,接种于96孔细胞培养板中,每孔100μl。于37℃、5%二氧化碳条件下培养4~6小时。将配制完成的标准品溶液和供试品溶液移入接种WISH细胞的培养板中,每孔加入100μl。于37℃、5%二氧化碳条件下培养18~24小时。弃去细胞培养板中的上清液。将保存的水泡性口炎病毒(VSV,-70℃保存)用攻毒培养液稀释至约100CCID50,每孔100μl。于37℃、5%二氧化碳培养24小时(镜检标准品溶液的50%病变点在1IU/ml)。然后弃去细胞培养板中的上清液,每孔加入染色液50μl,室温放置30分钟后,用流水小心冲去染色液,并吸干残留水分,每孔加入脱色液100μl,室温放置3~5分钟。混匀后,用酶标仪以630nm为参比波长,在波长570nm处测定吸光度,记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算试验结果供试品生物学活性(IU/ml)=Pr×Ds×Es
Dr×Er
式中Pr为标准品生物学活性,IU/ml;
Ds为供试品预稀释倍数;
Dr为标准品预稀释倍数;
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数;
Er为标准品半效稀释倍数。