【分享】高密度脂蛋白胆固醇的检测方法及标准化研究进展

二、HDL-C检测方法

由于所有脂蛋白都含有chol，因此必须从其他脂蛋白中分离出HDL后再行测定。分离HDL的方法有超速离心法、凝胶过滤法、免疫化学法、电泳法及化学沉淀法。临床化学实验室应用最广泛的是化学沉淀法。近来国外连续报道了几种HDL-C的直接测定方法，因其简便、快速，能进行自动化分析，已引起广泛关注。

1.参考方法：美国疾病控制与预防中心(CDC)测定HDL-C的参考方法为超速离心法，也为NCEP所推荐［4］。该法分三步进行：(1)超速离心(40000r/min，18.5小时)除去密度(d)＜1.006kg/L富含TG的脂蛋白(CM、VLDL)。(2)下层悬浮液用肝素-MnCl2法(Hep-Mn2+法)离心沉淀(1500×g，30分钟)，以除去富含apoB的脂蛋白［LDL、Lp(a)］。(3)测定上清液中chol含量，方法用CDC参考方法(ALBK法)。此法主要用于靶值的确定及各种HDL-C检测方法学评价，也是国际间人群调查研究准确性基础。由于需超速离心机，操作复杂且严格，所需标本量大(5ml血浆)，离心时间长，一般实验室难以开展，不适于大规模标本比较研究。CDC胆固醇参考方法实验室网络(Cholesterolreference Method LaboratoryNetwork,CRMLN)近来选用了一种“指定性比较方法”作为转移CDC参考方法准确性的适用方法。此法首先用硫酸葡聚糖(DS50，分子量5万)作沉淀剂(DS50-Mg2+)，离心沉淀，除去含apoB的脂蛋白［CM、VLDL、IDL、LDL和Lp(a)］；然后上清液HDL中胆固醇采用ALBK法测定。这种方法已在网络的每个实验室被仔细评价及成功地进行标准化，相对CDC参考方法而言，已大为简化［5］。发展与CDC参考方法结果具有可比性的改良简单化参考方法将会促进HDL-C标准化在常规实验室中的开展。

2.化学沉淀法：常用的沉淀剂为多阴离子，如磷钨酸(PTA)、DS、肝素(Hep)或非离子多聚体如聚乙二醇(PEG)与某些两价阳离子(如Mg2+、Ca2+、Mn2+)合用能使除HDL外含apoB的脂蛋白都沉淀。沉淀形成的机制还不十分清楚。HDL中chol多用酶法(CHOD-PAP)测定。此类方法操作简单，不需昂贵设备且费用较低，适用于普通实验室。被NCEP推荐为常规方法［5］。

早期的沉淀法如用Hep-Mn2+法，易受高TG干扰，使沉淀后的上清呈浑浊状，且Mn2+干扰酶法测定chol，故目前已基本不用。只是CDC-NHLBI(国立心肺血液学研究所)现存的有关HDL-C与CHD风险的流行病与临床数据库源于此法，故NCEP建议予以保留。PEG6000-Mg2+法沉淀效率高，与CDC参考方法有较好一致性，但精密度较差，美国现已很少采用。Warnick等［6］推荐用DS50-Mg2+法，认为其对分离HDL有较好特异性，但因国内试剂馈缺而限制了其应用。以往报道用DS500-Mg2+法(DS500，分子量为50万)测定HDL-C结果偏低，但将血清与沉淀剂之比改为1∶1后，高脂对VLDL沉淀的干扰大大降低，提高了检测的精密度与准确度［7］。PTA-Mg2+法不干扰酶法测定chol，且试剂易得，对高TG血清也能完全沉淀，是目前临床实验室应用最多的方法，美国有50%以上的商品试剂用此法。Demacker等［8］对常用6种沉淀法进行了比较，结果表明PTA-Mg2+法总误差为10.6%，符合NCEP要求。PTA-Mg2+法结果可靠，费用合理，适合常规应用。中华医学会检验学会也在国内推荐此法，并制定了详细检测草案［9］。


化学沉淀法多受高TG影响，含apoB颗粒因不能完全沉淀而导致HDL-C假性增高。为克服此缺点，美国ReferenceDiagnostics公司推出新一代磁化DS沉淀法检测试剂盒。其原理是单一沉淀剂与血清标本1∶5混合在一标本杯中，然后将标本杯放进磁盘，非HDL脂蛋白颗粒因被磁化，能很快被磁盘吸至杯底(沉淀)，而与HDL颗粒分离(上清)。此过程简单迅速，不需离心，无HDL共沉淀及含apoB颗粒沉淀不完全现象。结果准确，不受高TG干扰，比传统DS50-Mg2+法测定时间大大缩短，亦有一定应用价值［10］。

3.电泳法：在一定电场条件下，由于各种脂蛋白的分子大小及其在缓冲溶液中所带电荷数的不同，故在支持介质上迁移率亦不同。较小的HDL分子向阳极有较高的迁移率，可将HDL与VLDL、LDL区分开。Helena公司已开发可供REP快速全自动电泳仪使用的HDL-C检测试剂盒，其原理是：血清(1μl)经琼脂糖凝胶电泳(400V，15分钟)后，将chol基质试剂均匀铺在凝胶表面，孵育一段时间(10分钟)后用10%冰醋酸固定，然后将凝胶烤干。570nm波长下自动扫描即可确定HDL-C百分含量。同时将血清TC值输入，则可求得血清HDL-C值。此法与PTA-Mg2+法有较好相关性，可用于高TG标本检测，也常用于评价各种化学沉淀法沉淀是否完全等，目前多用于临床研究。

4.直接测定法：由于化学沉淀法测定HDL-C需将标本进行选择性沉淀预处理后，上清液方可用酶法或化学法测定chol。其最大缺点是不能进行自动化分析，尤其不适应大规模流行病学调查或临床大批量标本诸多项目同时检测。国外近几年相继研制开发出几种不需沉淀的直接测定法，可用于仪器自动化测定，为临床及时、快速、准确测定HDL-C及标准化工作提供了条件。(1)PEG/抗体包裹法：Kakuyama等［11］于1994年报道用PEG和抗apoB、抗apoCⅢ抗体包裹非HDL的脂蛋白，然后用酶法直接测定HDL-C的自动化分析方法。日本InternationalReagents公司已研制成功可供商品化自动检测的试剂盒。测定过程包括4种试剂：①低浓度的PEG4000，包裹CM、VLDL、LDL。②特异性抗apoB、apoCⅢ抗体，使CM、VLDL和LDL复合物凝聚。③酶试剂，用于检测上述复合物以外脂蛋白胆固醇(即HDL-C)。④盐酸胍试剂，终止酶促反应和溶解含apoB脂蛋白复合物，以免其干扰吸光度测定。Nauck等［12］对PEG/抗体包裹法进行了系统评价，认为该法与PTA-Mg2+法具有好的相关性(r=0.970)，总CV为2.4%～8.4%，线性范围可达1 500 mg/L，最小可信限～30mg/L。该法抗TG干扰能力强，TG为20g/L仅使结果增高2%。溶血使结果显著增高而黄疸使结果偏低。此法不需沉淀分离，易于操作和检测全自动，但由于试剂中需特异性抗体而使成本较高(约为PTA-Mg 2+法的20倍)，且需要可加4种试剂的生化分析仪分步加入4种试剂，因而限制了其临床应用，目前仅用于如Hitachi911型等自动生化分析仪。(2)选择性抑制法：应用两种不同的表面活性剂及多阴离子，根据脂蛋白的酶反应选择性，直接测定HDL-C。第一反应中，加入多阴离子和分散型表面活性剂(亦称反应抑制剂)，LDL、VLDL和CM先在多阴离子下聚集，由于反应抑制剂与LDL、VLDL和CM的疏水性基因具有高度亲和力，故其吸附在聚集的脂蛋白颗粒表面形成遮蔽圈。同时在HDL表面也吸附有少量反应抑制剂，但由于亲和力较弱，其结合是可逆的。第二反应中，与胆固醇酶试剂一起加入具有对HDL颗粒中亲水性基团具有亲和力的可溶性表面活性剂(亦称反应促进剂)，由于反应促进剂对HDL可溶性的强特异性作用可置换其表面吸附的少量反应抑制剂，从而与酶试剂反应，达到无需沉淀分离直接测定HDL-C的目的。1995年日本第一化学药品株式会社(Daiichi)推出第一代可供自动化检测的商品化试剂盒，该试剂盒中的酶试剂是冻干品，复溶后一周即见变色，影响测定效果。1996年下半年推出第二代液体双试剂，试剂稳定，适合于各类自动生化分析仪。美国GenzymeDiagnostics公司的商品化试剂盒N-genousTMHDL-C亦属此类方法。此法所需标本量少(3μl血清)，精密度高(批内、批间CV均?%)，与PTA-Mg2+法相关性好(r=0.987)，线性范围可达1 500mg/L，回收率90%～110%。血红蛋白、Vitc对测定无影响，胆红素对测定影响尚存在争议［13，14］。Huang等［14］研究发现选择性抑制法检测HDL-C特异性稍差，可能由于第一步反应中非HDL的不完全包裹遮蔽，而使酶试剂与其中CM、VLDL和LDL中胆固醇发生反应，使结果假性增高。因此，在临床广泛推广应用此法前，必须对校准系统重新标准化以提高其特异性。(3)PEG修饰法：Sugiuchi等［15］于1995年报道应用PEG修饰酶对不同脂蛋白中胆固醇反应的选择性，在α-环糊精硫酸盐和Mg2+及少量DS作用下，不需预先分离沉淀直接测定血清HDL-C的方法。由于PEG6000能引起胆固醇酯酶(CEH)和胆固醇氧化酶(CHOD)的变构，变构酶PEG-CEH和PEG-CHOD对脂蛋白的催化作用有选择性，其顺序依次为LDL＜≈CM＜。而α-环糊精硫酸盐能限制CM、VLDL颗粒进入环状的环糊状结构，从而避免酶的催化作用，这种作用还与Mg2+浓度有关。因此，在Mg2+及少量DS存在前提下，可直接检测HDL-C。日本协和(Kyowa)、德国Centronic gmbH BoehringerMannheim及英国RANDOX公司等已分别研制出可供自动化检测的商品试剂盒。此法所需血清量少(4 μl)，线性范围宽(达1 500mg/L)，精密度高(批内、批间CV均?%)，回收率为99%～103%，黄疸、溶血对检测结果影响较小，不受Vitc、肝素等干扰，与PTA-Mg2+法具有良好相关性(r=0.975)。虽然PEG修饰法在高TG(30000mg/L)时PEG变构酶能与VLDL反应，而使结果轻度偏高，但总误差仍在NCEP可接受范围之内［10］。有作者认为，PEG修饰法在特异性与准确度方面优于选择性抑制法［14］，而更适用于常规实验室。

三、HDL-C检测的标准化

HDL-C是血脂分析的常规项目，已越来越引起临床的重视。研究表明，HDL-C测定误差可引起LDL-C计算误差，其结果小的误差可引起CHD风险估计的严重错误。因此，必须开展检测的标准化工作以保证测定结果的准确可靠性。HDL-C检测的标准化主要在于方法的合理选择、标准品和质控材料的制备及标准化方案的制定与实施等。

1.标准化目标：CDC-NHLBI的标准化程序对HDL-C检测的可接受限的目标进行了规定。要求检测准确度在CDC参考值(RV)的±10%以内，在小于1.03 mmol/L(40 mg/dl)、1.03～1.55 mmol/L(40～60 mg/dl)、大于1.55 mmol/dl(60mg/dl)浓度范围内，HDL-C检测的最大不精密度s分别为0.065 mmol/L(2.5 mg/dl)、0.078 mmol/L(3.0mg/dl)、0.090 mmol/L(3.5 mg/dl)。NCEP目前暂定目标为总误差≤22%；精密度要求HDL-C≥1.09mmol/L(42 mg/dl)时，CV≤6%；HDL-C?.09 mmol/L(42 mg/dl)时，s≤0.065mmol/L(2.5mg/dl)。准确度要求偏差(bias)≤±10%(与CDC参考方法比较)。1998年后目标为总误差≤13%；精密度要求HDL-C≥1.09mmol/L(42 mg/dl)时，CV≤4%；HDL-C?.09 mmol/L时，s≤0.044mmol/L(1.7mg/dl)。准确度要求偏差≤±5% ［5］。

2.标准物和质控材料：HDL-C标准化工作首先需要建立一套完整方案，评价和制备合适的参考材料和标准物。当前国际上已有良好的TC分析系统及可靠的标准参考物质，为HDL-C标准化工作创造了条件。我国已经研制出与美国标准和技术研究所(NIST)的胆固醇纯品SRM911b相当的胆固醇标准物及用参考方法定值的低胆固醇定值血清［16］。CAP通过研究证实，基质效应(matrixeffects)影响沉淀法测定HDL-C。其调查一些检测仪器和方法的线性发现，基质效应明显影响检测线性，而且影响源于沉淀步骤。因此，要求标准物和质控材料应不受基质效应影响或影响最小，适于HDL-C测定方法校准、标准化和质量控制，能用于检测准确度与精密度，稳定时间长，而且能用于国际和国内室间调查与评价。由于HDL颗粒不稳定，脂蛋白各组分中apoB经常变化，使得制备合适HDL-C标准物较为困难。目前各厂家提供的校准物和质控材料多为冻干品，亦有液体状，而且定值差别甚远。CDC一直采用冰冻混合血清作为参考物质用于HDL-C标准化，值得借鉴。近来陆续开发的自动化检测方法虽为标准化提供了方便，但对校准品和质控材料提出了更高要求。一方面需要满足上述基本要求，另一方面临床期望其还能同时用于其他项目的仪器校准和质量控制。这也是HDL-C研究的课题之一。

3.方法学问题：由于目前尚无HDL-C测定的决定性方法及一级参考材料，使HDL-C标准化工作难度更大。NCEP近来对HDL-C检测进行了系统回顾，并推荐了HDL-C的整个测定方案。推荐CDC采用的超速离心法为参考方法，沉淀法为常规方法。对标准化目标，如何减少分析前误差(包括受试者的准备、标本采集、处理和贮存等)，检测过程中应注意问题(包括如何减小基质效应影响、提高沉淀特异性和进行质控)及室间质评等也提出了一些具体要求与建议。根据我国1996年临床化学室间质评小结，国内目前仍多用沉淀法测定HDL-C，其中PTA-Mg2+法占首位(61.8%)，其次为PEG6000法(24.3%)。所以当前任务是对分离条件规范化，临床标本应用新鲜血清进行检测以避免基质效应。同时制备标准物和包括沉淀步骤在内的定值血清，以对整个检测过程进行标准化。对几种自动化检测方法进行系统评价，也有待于进一步深入研究与探讨。

不错，学习了！

楼主很辛苦啊

综述性研究进展，还不错！