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【分享】PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌
去年冬天
2011/05/17
私聊
食品毒素/微生物检测
一、实验目的
掌握PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌具体方法及操作步骤。
二、实验原理
聚合酶链反应(polymerase chain reaction )简称PCR,是一种体外酶促合成反应,扩增特定DNA片断的方法。该技术于1985年由美国的KaryMullis等人首创并由美国GETUS公司开发。其原理是:在存在DNA模板、引物、dNTP、适当缓冲液(Mg2+)的反应体系中,在热稳定DNA聚合酶的催化下,对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片断进行扩增。这种扩增是通过模板DNA、引物之间的变性、退火(复性)、延伸等三步反应为一个周期,循环进行,使目标DNA片段得以扩增。由于每一周期产生的DNA片断均能成为下一次循环的模板,故PCR产物以指数形式增加,从而实现信号的放大。
本实验以金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶为靶基因进行检测。
三、实验材料
1.菌种:Staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌)-26003-21
2.乳制品:全脂乳、脱脂乳和奶酪均购自当地超市。
3.培养基:营养肉汤培养基
4.化学试剂:10xPCR buffer、dNTPs、TaKaRa Taq、DNA Marker DL2000,
5.引物: 正向引物:GCGATTGATGGTGATACGGTT
反向引物:AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC
6.实验仪器:PCR仪、DXY-33A型电泳仪、UVIpro凝胶成像系统
四、实验步骤
1.将已人工污染的乳品25ml接入225ml营养肉汤培养基中,37℃振荡培养过夜
2.取1ml培养液于1.5ml离心管中,11000rpm,离心1分钟,弃去上清液
3.用灭菌的纯水洗涤菌体沉淀两次,再用100ul灭菌纯水溶解沉淀物
4.将菌悬液于沸水浴中煮沸10分钟,11000rpm,离心1分钟,取上清液,备用
5.PCR反应体系:总反应体系50ul。包括5ul 10XPCR buffer ,4ul dNTPs混合物,0.5ul 40umol正向引物,0.5ul40umol反向引物,0.25ul(5U/ul)Taq酶,模板2ul,水37.75ul。
6.PCR扩增程序:PCR反应采用冷启动。94℃预变性4分钟,再按94℃1分钟-52℃0.5分钟-72℃1.5分钟进行35个循环,最后72℃延伸3.5分钟。
7.电泳检测:取5ul PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳,利用凝胶成像系统观察结果并成像。
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