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【原创】液相色谱学习心得(第一期了解分叉峰)2011.5.24 更新(关于反冲色谱柱)

Telinga-MY

2011/05/22

液相色谱（LC）

2011.5.24 更新. 反冲对于洗掉色谱柱头积累的密封圈磨损下来的碎屑以及其他污染物很比较好的作用.但nixiaolong同学提出了很好的问题: 楼主文章中不断提到反冲色谱柱可是有些工程师不建议我们这么做会降低柱效.
反冲色谱柱是否会降低柱效呢?
1. 简单来说，绝大多数硅胶基质的色谱柱,正用反用都是一样,没有多大区别. 反着用也不会对色谱柱柱效产生影响。
2. 小心起见的话，建议大家看随色谱柱来的一小页的说明. 上面可能都有注明该色谱柱是否可以反冲.如果没说，一般都是可以反冲的。
3. 还有一个问题,就是反冲后，是把柱子调回来用，还是就这么反着用呢？
在有些色谱柱压力高的时候，反冲一段时间后，压力下降到正常。换回正常的方向没多久又开始升高，这个时候，可以考虑就将色谱柱反着用。
4. 有一种情况下，色谱柱不能长期反冲，就是色谱柱前后筛板孔径不一致的时候。有些3u色谱柱入口筛板孔径可能是2u，出口0.5u。这样可以让色谱柱承受更大的压力(因为出口比较小)。这种情况下，反冲一小段时间问题不大，但是时间长了以后，可能造成有些填料被冲出色谱柱，造成柱效下降的情况。如何防止这个问题出现呢？还是那句话，看说明书，看手册。
RTFM！与大家共勉：）

2011.5.22 要重新开始学习色谱的一些原理和故障诊断，开这个帖子，跟大家分享一下学习笔记。欢迎大家交流。也算是对自己的一种监督。学习资料来自LCGC杂志的各个专栏。

做液相的同学基本都会碰到分叉峰. 很多时候,这都意味着硬件或者方法某些地方可能出现问题.这里我们一起看看导致峰分叉的原因以及如何解决这个问题的一些指导性的方法.

1. 首先,我们需要判断,这到底是一个峰,还是两个峰?

A图主峰前面有一个肩峰.这到底是峰形不好,还是另外一个化合物没分开呢?

判断办法:降低该成分在样品中的浓度.

B图是降低该成分浓度后,进样后得到的色谱图.

如果这是一个峰,那肩峰也应该响应变小. 但是,这个例子里,肩峰没有变小,这应该是另外一个化合物.这时候,我们就要考虑如何改变方法,将这两个东西分开.

2. 所有峰的峰形都不好.

一般来说,一个样品都会出多个峰. 峰形不好,绝大多数时候,在每个峰上面都会出现. 比如像下面这样:

A图是所有峰都拖尾.

B 图是所有峰都有肩峰,也可以说峰分叉.

这种情况一般都是色谱柱头塌陷或者柱头的筛板被堵导致的. 为什么导致峰型问题呢? 请看下面的图.

A图是正常的柱头.B图是筛板被堵的柱头.

正常情况下,所有样品分子都是均匀通过色谱柱的,形成一个对称的峰形.

堵塞得情况下,有一部分样品分子进入色谱柱就会收到阻扰,导致时间拖后,形成拖尾.

对于色谱柱塌陷的情况,用同样的方法,大家也不难理解.只不过这时候,是一些样品分子可能跑的比正常的快了一些.

如何解决这个问题呢:

1. 反冲. 柱出口放空，冲20-30ml流动相。虽然柱子上都有表明使用方向, 但是对于硅胶基质的色谱柱,基本都可以反冲.

将柱头污染物(泵密封圈的碎屑，样品中的污染等)冲走，就能解决问题。当然，还是要提倡大家注意样品上机之前的前处理和及时更换磨损的泵密封圈。有条件的，还是用保护柱，大不了就换保护柱，也比换色谱柱强。

2．更换或清洗筛板。现在估计做这个事情的人不多，但是谁有废柱子，想练练也未尝不可。

案例分析：

我们一起看看一个实际的例子。

根据之前说的，可能是柱头堵了，或者塌陷了。但是进一步检查，发现另有原因。

方法用的150 mm 4.6 mm, 5- um C18 柱子，78% 乙腈，1.5ml/min，等度方法，进样10ul，100%乙腈溶解的样品。

一般来说，虽然10ul的纯乙腈不会引起峰形不好，但是有时候样品溶剂的极性跟流动相差异较大时，的确会引起峰形的问题。

我们怎么办呢：

1．从最容易的办法做起，降低溶剂乙腈的比例。降到50%看看。从下图B，4min的峰可以看出，没啥改观。

2．接下来反冲柱子，结果图C，基本没变化。算，每天再说吧。

3．第二天来到实验室，还能干嘛呢？更换筛板？算了，直接换柱子吧。结果如D，噢，好很多噢。之前柱子肯定有问题，扔了。但是峰还是有点宽，估计还是哪儿有问题。

4．手上忙，没时间管这个。几天过后，重新配了流动相，一跑，好了。如图E。

虽然到底什么原因导致的之前峰形的问题已经无从查找(柱子扔了，旧流动相也没了)，但是也给我们一个解决问题的步骤：

1．确定峰形问题是所有峰都有问题，还是就是某一个峰有问题。如果所有峰都有问题，基本都是色谱柱，或者仪器管路连接的问题。如果是某一个峰有问题，那就要从方法上来考虑，是否需要改变流动相比例，pH值，色谱柱温度等等。

2．从最简单的做起，从不需要换什么东西的方法做起。比如改变样品溶剂，反冲色谱柱等等。

3．换东西。换保护柱，换色谱柱，换流动相(新配)。一步一步的换，有助于找到问题的根本。

4．问题解决后，想想需不需要采取什么措施，防止类似问题的发生，比如说常换流动相啦，即时更换密封圈啦，记录进样次数了解什么时候色谱柱就不行了啊之类的。

希望以上信息能够让各位同学在碰到峰形不好的问题时候，有一些思路，不至于手足无措。也欢迎大家一起来讨论和补充上面没有提到的可能影响峰形的可能。

精
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happydog2004

第1楼2011/05/23

宝贵经验，占个位子，来学习~

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yuduoling

第2楼2011/05/23

楼主真是有心人，把经验全总结下来了。多谢分享

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arvid2007

第3楼2011/05/23

楼主是不是以后会继续开展下去，挺不错的心得分享。

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fyzhong7070

第4楼2011/05/23

好材料，收下了。

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lvxinxiaoxi

第5楼2011/05/23

受益匪浅啊，一定好好学习

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dahua1981

第6楼2011/05/23

应助达人

很有实际应用价值的经验

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给力芬

第7楼2011/05/23

很全面，多谢楼主

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linliu5795

第8楼2011/05/23

更换色谱柱，旧色谱柱可能是不适合分离这种样品吧

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Telinga-MY

第9楼2011/05/23

昨天晚上发的帖子,今天看已经被推荐了.感谢大家的支持,希望很快能有第二期,第三期出来.

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king2138

第10楼2011/05/23

分析得不错，坐等后续更新。

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