高效液相色谱在化工制药领域的研究现状

vincentrc

2011/08/10

私聊

液相色谱（LC）

高效液相色谱在化工制药领域的研究现状

摘要综述了高效液相色谱的发展现状及其发展历史，对未来高效液相色谱法在化工制药领域的广泛应用做了分析研究和预测。

关键词 高效液相色谱化工制药 HPLC 离子交换 GC-MS

引言

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等，是20世纪60年代急剧发展起来的一项高效、新颖、快速的分析分离技术^[1]。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。近年来，该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术，尤其在化工制药领域中扮演着相当重要的“角色”^[2]。

1.高效液相色谱法的类型及其分离原理^[3]

高效液相色谱法分为：液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。

1.1液-固色谱法（液-固吸附色谱法）

①液-固色谱法的作用机制

吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。
　　流动相中的溶质分子X（液相）被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应：
　　X（液相）+nS（吸附）<==>X（吸附）+nS（液相）
　　其作用机制是溶质分子X（液相）和溶剂分子S（液相）对吸附剂活性表面的竞争吸附。
　　吸附反应的平衡常数K为：
　　K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。
　　K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。
　　发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。

②液-固色谱法的吸附剂和流动相

常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。

一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。

对流动相的基本要求：
　　1.试样要能够溶于流动相中
　　2.流动相粘度较小
　　3.流动相不能影响试样的检测

常用的流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。

③液-固色谱法的应用

常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不；数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同的异构体；但液-固色谱法不宜用于分离同系物，因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。

1.2液-液色谱法（液-液分配色谱法）

①液-液色谱法的作用机制

溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。

液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：K=C_固/C_液

K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。

②正相色谱和反相色谱

正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相。

反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相。

一般地，正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性，而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性。正相色谱适宜于分离极性化合物，反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性化合物。

③液-液色谱法的固定相

常用的固定液为有机液体，如极性的β，β′氧二丙腈（ODPN），非极性的十八烷（ODS）和异二十烷（SQ）等。

④液-液色谱法的应用

液-液色谱法既能分离极性化合物，又能分离非极性化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、稠环、染料、留族等化合物。化合物中取代基的数目或性质不同，或化合物的相对分子质量不同，均可以用液-液色谱进行分离。

1.3.离子交换色谱法

原理：离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的被测离子进行可逆交换，由于被测离子在交换剂上具有不同的亲和力（作用力）而被分离。

①离子交换色谱法的作用机制

聚合物的分子骨架上连接着活性基团，如：-SO₃-，-N（CH₃）3⁺等。为了保持离子交换树脂的电中性，活性基团上带有电荷数相同但正、负号相反的离子X，称为反离子。活性基团上的反离子可以与流动相中具有相同电荷的被测离子发生交换：

离子交换色谱的分配过程是交换与洗脱过程。交换达到平衡时：

K值越大，保留时间越长。

②溶剂和固定相

两种类型：多孔性树脂与薄壳型树脂。

多孔性树脂：极小的球型离子交换树脂，能分离复杂样品，进样量较大；缺点是机械强度不高，不能耐受压力。

薄壳型离子交换树脂：在玻璃微球上涂以薄层的离子交换树脂，这种树脂柱效高，当流动相成分发生变化时，不会膨胀或压缩；缺点是但柱子容量小，进样量不宜太多。

③离子交换色谱法的应用

主要用来分离离子或可离解的化合物，凡是在流动相中能够电离的物质都可以用离子交换色谱法进行分离。

广泛地应用于：无机离子、有机化合物和生物物质(如氨基酸、核酸、蛋白质等)的分离。

1.4.凝肤色谱法（空间排阻色谱法）

凝胶是一种多孔性的高分子聚合体，表面布满孔隙，能被流动相浸润，吸附性很小。凝胶色谱法的分离机制是根据分子的体积大小和形状不同而达到分离目的。

①凝胶色谱法的作用机制

体积大于凝胶孔隙的分子，由于不能进入孔隙而被排阻，直接从表面流过，先流出色谱柱；小分子可以渗入大大小小的凝胶孔隙中而完全不受排阻，然后又从孔隙中出来随载液流动，后流出色谱柱；中等体积的分子可以渗入较大的孔隙中，但受到较小孔隙的排阻，介乎上述两种情况之间。

凝胶色谱法是一种按分子尺寸大小的顺序进行分离的一种色谱分析方法。

②凝胶色谱法的固定相

软质凝胶、半硬质凝胶和硬质凝胶三种。

③凝胶色谱法的应用特点

保留时间是分子尺寸的函数，适宜于分离相对分子质量大的化合物，相对分子质量在400～8×105的任何类型的化合物。

保留时间短，色谱峰窄，容易检测。

固定相与溶质分子间的作用力极弱，趁于零，柱的寿命长。

不能分辨分子大小相近的化合物，分子量相差需在10%以上时才能得到分离。

2、高效液相色谱法的特点^[4]

2.1高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。

　　2．2高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。

　　2.3高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。

　 2.4应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。

　　2.5分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。

　　此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。

3、高效液相色谱在化工制药领域的应用

近年来，国内外许多专家学者将高效液相色谱技术应用于天然产物、农药和食品等行业中，在化工制药领域的应用效果也十分明显。^[5]

3.1对有效成分的快速检测识别^[6]

药物中的有效成分是药物先导分子的重要源泉之一，它们种类繁多，结构复杂多样 ,进行结构分析鉴定时,往往费时费力，目标性不强，且常常忽略含量甚少的微量成分 . 高效液相色谱及多级质谱联用技术 (HPLC/MS ⁿ) 兼顾了色谱的高效分离能力和质谱的强大定性能，为药物中的有效成分的分析研究提供了新途径。检测识别变得高效快速稳定的进行提供大量可靠、精确的数据信息，简化试验步骤、节约分析时间，具有灵敏度高、操作简便、可实现高通量样品分析等优点。

3.2对产品进行含量测定、组成分析、质量控制^[7]

在药物分析中, 高效液相色谱由于其专一性,灵敏度高,快速简便的特点,广泛的应用于药物分析中的定量分析, 尤其在干扰因素较多的时候表现出更大的优越性。关日晴采用高效液相色谱法测定盐酸洛美沙星滴眼液中的洛美沙星含量;用C柱为分离柱,0. 02m ol ö nm 酸溶液(用三乙胺调节pH值至2. 6)- 乙腈(体积比85:15) 为流动相,检测波长287nm ; 洛美沙星进样量在0. 48～0. 72 L g范围内与峰面积线性关系良好(r= 0. 9998), 平均回收率100. 4% ,重复进样的RSD0. 33% (n = 6) 。

总结

高效液相色谱是目前各种色谱模式中应用最广的一个领域，世界上几百万种化合物中 80%的化合物，包括大（高）分子化合物、离子型化合物、热不稳定型化合物以及有生物活性的化合物都可以用不同模式的HPLC进行分离分析，而现在通GC-MS联用，与核磁共振、高光敏度检测、电感偶合等离子体质谱、固相微萃取联用，使HPLC成为在药物研究所、检测所、药厂和临床检测中的主要分离分析工具。^[8]，[9]今后，随着各种分析分离技术的出现及联用技术的发展，HPLC将会被应用到更广的领域。高效液相色谱法由于分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广、组分易回收、样品处理较简单等优点在确定药方案和治疗剂量,以及药物动力学分析和药效学评价提供了方法的基础,有着广泛的应用前景。

参考文献

[1] 周如梅.高效液相色谱及其应用[J]，湖南长沙湖南省有色地质勘查研究院企业技术开发第 24卷第6期

[2] 李发美.分析化学 [M ].5版,北京人民卫生出版社,2004:417-8.

[3]白鹏.制药工程导论[M] 北京化学工业出版社

[4]孙翠荣 , 陈娟娟 , 潘远江高效液相色谱 / 质谱联用技术在天然来源生物活性成分快速识别中的应用[J], 杭州浙江大学化学系，中国科学: 化学2010年第40卷第6期: 621 ~ 630

[5] Tai YP, Pei SF, Wan JP, Cao XJ, Pan YJ. Fragmentation study of protonated chalcones by atmospheric tandem mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom , 2006, 20(6): 994 — 1000

[6]严基东，高效液相色谱在现代医药科研的应用[J]，牡丹江医学院医学与药物开发重点实验室，牡丹江医学院学报2006年第27卷第3期

[7]张良晓高效液相色谱在药物分析中的应用研究进展中国地质大学 ( 武汉 ) 材料科学与化学工程学院[J], 武汉　内蒙古石油化工2005 年第 7 期　

[8]杨更亮 ,刘海燕，高效液相色谱整体柱在药物分离分析中的应用进展[J]，河北大学药学院 ; 河北省药物质量分析控制重点实验室 , 保定中国科学:化学2010年第40卷第6期: 631 ~ 640

[9]张春婷，王磊，国产高效液相色谱仪在制药工业中的应用[J] ,哈药集团制药总厂、复旦大学，黑龙江医药2006年19卷第3期

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