显微摄像知识四

zhbvssong

2011/09/01

私聊

生物显微镜

第五章各种显微镜技术介绍
前面讲述了显微镜的光学原理以及附件，下面将分类介绍一下各类研究用镜检术。在生物研究领域，透射式明场显微镜得到广泛应用，在此基础上各种特殊的镜检方法也得到应用，如相衬，荧光，干涉，暗场，这些镜检方法在高档显微镜上均能同时实现，如OLYMPUS BX51 ,BX61等.在此将分类介绍。
第一节正立式显微镜
一．明视野观察（Bright field）
明视野镜检是大家比较熟悉的一种镜检方式，广泛应用于病理、检验，用于观察被染色的切片，所有显微镜均能完成此功能。在此不再赘述。OLYMPUS 此类显微镜有CX21/31/41等。
二．暗视野观察（Dark field）
暗视野实际是暗场照明发。它的特点和明视野不同，不直接观察到照明的光线，而观察到的是被检物体反射或衍射的光线。因此，视场成为黑暗的背景，而被检物体则呈现明亮的象。
暗视野的原理是根据光学上的丁道尔现象，微尘在强光直射通过的情况下，人眼不能观察，这是因为强光绕射造成的。若把光线斜射它，由于光的反射，微粒似乎增大了体积，为人眼可见。
暗视野观察所需要的特殊附件是暗视野聚光镜。它的特点是不让光束由下至上的通过被检物体，而是将光线改变途径，使其斜射向被检物体，使照明光线不直接进入物镜，利用被检物体表面反射或衍射光形成的明亮图象。
暗视野观察的分辨率远高于明视野观察，最高达0.02—0.004mm..
三．相衬镜检法（Phase contrast）
在光学显微镜的发展过程中，相衬镜检术的发明成功，是近代显微镜技术中的重要成就。我们知道，人眼只能区分光波的波长（颜色）和振幅（亮度），对于无色通明的生物标本，当光线通过时，波长和振幅变化不大，在明场观察时很难观察到标本.
相衬显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检，也就是有效地利用光的干涉现象，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，即使是无色透明的物质也可成为清晰可见。这大大便利了活体细胞的观察，因此相衬镜检法广泛应用于倒置显微镜如OLYMPUS CKX31/41，IX71等等。
相衬镜检法在装置上与明场不同，有一些特殊要求：
1．环状光阑（Ring slit）: 装在聚光镜的下方，而与聚光镜组合为一体---相衬聚光镜。它是由大小不同的环形光阑装在一圆盘内，外面标有10X、20X、40X、100X等字样，与相对应倍数的物镜配合使用。
2．相板（Phase plate）: 装在物镜的后焦平面处，它分为两部分，一是通过直射光的部分，为半透明的环状，叫共轭面；另一是通过衍射光的部分，叫“补偿面”。有相板的物镜称“相衬物镜”，外壳上常有“Ph”字样。
相衬镜检法是一种比较复杂的镜检方法，想要得到好的观察效果，显微镜的调试非常重要。除此之外还应注意以下几个方面。
1．光源要强，全部开启孔径光阑；
2．使用滤色片，使光波近于单色；
四．微分干涉称镜检术（Differential interference contrast DIC）
微分干涉镜检术出现于60年代，它不仅能观察无色透明的物体，而且图象呈现出浮雕壮的立体感，并具有相衬镜检术所不能达到的某些优点，观察效果更为逼真。
1．原理
微分干涉称镜检术是利用特制的渥拉斯顿棱镜来分解光束。分裂出来的光束的振动方向相互垂直且强度相等，光束分别在距离很近的两点上通过被检物体，在相位上略有差别。由于两光束的裂距极小，而不出现重影现象，使图象呈现出立体的三维感觉。
2．微分干涉称镜检术所需的特殊部件：
（1）起偏镜
（2）检偏镜
（3）渥拉斯顿棱镜2 块
3．微分干涉称镜检时的注意事项
（1）因微分干涉衬灵敏度高，制片表面不能有污物和灰尘。
（2）具有双折射性的物质，不能达到微分干涉衬镜检镜检的效果。
（3）倒置显微镜应用微分干涉衬时，不能用塑料培养皿。
五荧光镜检术
荧光镜检术是用短波长的光线照射用荧光素染色过的被检物体，使之受激发后而产生长波长的荧光，然后观察。荧光镜检术广泛应用于生物，医学等领域。
1．荧光镜检术一般分为透射和落射式两种类型。
（1）透射式：激发光来自被检物体的下方，聚光镜为暗视野聚光镜，使激发光不进入物镜，而使荧光进入物镜。它在低倍情况下明亮，而高倍则暗，在油浸和调中时，较难操作，尤以低倍的照明范围难于确定，但能得到很暗的视野背景。透射式不使用于非透明的被检物体。
（2）落射式：透射式目前几乎被淘汰，新型的荧光显微镜多为落射式，光源来自被检物体的上方，在光路中具有分光镜，所以对透明和不透明的被检物体都适用。由于物镜起了聚光镜的作用，不仅便于操作，而且从低倍到高倍，可以实现整个视场的均匀照明。
2．荧光镜检术的注意事项
（1）激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象，因此尽可能缩短观察时间，暂时不观察时，应用挡板遮盖激发光。
（2）作油镜观察时，应用“无荧光油”。
（3）荧光几乎都较弱，应在较暗的室内进行。
（4）电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。
目前许多新兴生物研究领域应用到荧光显微镜，如基因原位杂交（FISH）等等。

第二节偏光显微镜（Polarizing microscope ）
一．偏光显微镜的特点
偏光显微镜是鉴定物质细微结构光学性质的一种显微镜。凡具有双折射的物质，在偏光显微镜下就能分辨的清楚，当然这些物质也可用染色发来进行观察，但有些则不可能，而必须利用偏光显微镜。
偏光显微镜的特点，就是将普通改变为偏光进行镜检的方法，以鉴别某一物质是单折射（各向同行）或双折射性（各向异性）。
双折射性是晶体的基本特性。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物，化学等领域。在生物学和植物学也有应用。
二．偏光显微镜的基本原理
偏光显微镜的原理比较复杂，在此不作过多介绍,偏光显微镜必须具备以下附件（a）器偏镜（b）检偏镜（c）专用无应力物镜（d）旋转载物台。
三．偏光镜检术的方式
（一）正相镜检（Orthscope）:又称无畸变镜检，其特点是使用低倍物镜，不用伯特兰透镜（Bertrand Lens）,同时为使照明孔径变小，推开聚光镜的上透镜。
正相镜检用于检查物体的双折射性。
（二）锥光镜检（Conoscope）：又称干涉镜检，这种方法用于观察物体的单轴或双轴性。
四．偏光显微镜在装置上的要求
（一）光源：最好采用单色光，因为光的速度，折射率，和干涉现象由于波长的不同而有差异。一般镜检可使用普通光。
（二）目镜：要带有十字线的目镜。
（三）聚光镜：为了取得平行偏光，应使用能推出上透镜的摇出式聚光镜。
（四）伯特兰透镜：这是把物体所有造成的初级相放大为次级相的辅助透镜。
五．偏光镜检术的要求
（一）载物台的中心与光轴同轴。
（二）起偏镜和检偏镜应处于正交位置。
（三）制片不宜过薄。
OLYMPUS 偏光显微镜有BX51-P

第三节倒置显微镜（Inverted microscope）
前面讲的是正立式显微镜的镜检方式，主要用于切片的观察。而倒置显微镜是为了适应生物学、医学等领域中的组织培养、细胞离体培养、浮游生物、环境保护、食品检验等显微观察。
由于上述样品特点的限制，被检物体均放置在培养皿（或培养瓶）中，这样就要求倒置显微镜的物镜和聚光镜的工作距离很长，能直接对培养皿中的被检物体进行显微观察和研究。因此，物镜、聚光镜和光源的位置都颠倒过来，故称为“倒置显微镜”。如OLYMPUS CKX31/41，IX51，IX71 等。
由于工作距离的限制，倒置显微镜物镜的最大放大率为60X。一般研究用倒置显微镜都配置有4X、10X、20X、及40X 相差物镜，因为倒置显微镜多用于无色透明的活体观察。如果用户有特殊需要，也可以选配其它附件，用来完成微分干涉、荧光及简易偏光等观察。
目见倒置显微镜广泛应用于patch-clamp ,transgene ICSI 等领域。
第四节体视显微镜（Stereo microscope）
体视显微镜又称“实体显微镜”或“解剖镜”，是一种具有正象立体感地目视仪器，被广泛地应用于生物学、医学、农林、工业及海洋生物各部门。它具有如下地特点：
1．双目镜筒中的左右两光束不是平行，而是具有一定的夹角---体视角（一般为12度---15度），因此成象具有三维立体感；
2．象是直立的，便于操作和解剖，这是由于在目镜下方的棱镜把象倒转过来的缘故；
3．虽然放大率不如常规显微镜，但其工作距离很长，如OLYMPUS SZX12 可达198mm；
4．焦深大，便于观察被检物体的全层。
5．视场直径大。
目前体视镜的光学结构是：由一个共用的初级物镜，对物体成象后的两光束被两组中间物镜----变焦镜分开，并成一体视角再经各自的目镜成象，它的倍率变化是由改变中间镜组之间的距离而获得的，因此又称为“连续变倍体视显微镜”（Zoom—stereo microscope）。
OLYMPUS 最新型体视显微镜SZX 系列，即为此种显微镜。
随着应用的要求，目前体视镜可选配丰富的选购附件，如荧光，照相，摄象，冷光源等等。

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