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一波三折的样品方法调试过程(9月)

  • huaibeijiayuan
    2011/09/23
  • 私聊

液相色谱(LC)

  • 因受市场行情波动的影响,公司一个产品原材料A(因涉及公司秘密,因而用字母代替)变得比较紧缺,而此产品又是公司的主打产品,为了减少或取消这种市场对公司产品的冲击,去年公司领导层经过多次论证,决定新上一个项目------生产A原料。生产车间是去年年初进行土建工程建设,在去年下半年进行安装调试并进行了试生产,刚开始生产还比较顺利,产率与理论相接近,随着生产的持续进行,发现检测结果与生产成本的误差越来越大,因此就开始查找原因。

    作为检验部门首先就是检查方法的可行性和正确性,排除操作带来的误差。后来技术部门提出这个产品的异构体变大导致结果虚高,当时的检测方法是化学滴定法,异构体也会参与反应,最终导致检测结果虚高。于是我们部门就开始查找资料,摸索其他的分析方法,这个产品为有机酸类,因此考虑用HPLC进行分析,但在网络上查找不到相关的分析方法的介绍,意味着需要自己摸索。

    首先取出反应液做个波长扫描,发现在220-250nm230-245nm240-260nm分别有较强的紫外吸收,通过分析、确认,判断出220-250nm240-260nm为此产品的两种主要原料,230-245就是我们的产品,因此最终确定检测波长定为240nm。波长确定后就是选择流动相了,考虑的样品为有机酸,在溶液中应该有很好的溶解性,初步确定为甲醇和水,谁知出现一个两难的问题:甲醇比例大,组分分不开;甲醇比例小,分析时间太长;甲醇与水同等比例吧,泵压太高了,最终放弃甲醇作流动相,次而选择乙腈。
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  • huaibeijiayuan

    第1楼2011/09/23

    因为当时有个乙腈/=60/40的流动相就先进一针试试吧,主峰在7min左右,原料在14min'左右出来,另一个原料在3min左右,考虑到不知是否还有其他杂质,于是选用了一个梯度的检测方法,色谱柱选用的是月旭的AQ-C18色谱柱,流动相为乙腈/水(0.1%三氟乙酸)=60/40,为什么用三氟乙酸呢?刚才已经说了是临时借用的其他产品的流动相调试的,所以就没有做改动了。

    分析条件:

    色谱柱:上海月旭公司的AQ-C18色谱柱;250mm*4.6mm5um

    梯度方法:流动相:A/B=ACN/0.1%三氟乙酸 梯度

    0 60 40

    13 95 5

    22 60 40

    这是分析的谱图。图片1



    从谱图上看,组分的异构体没有显现出来,当时的样品是主产品:异构体=1:1,谱图中仅显示一个组分,并且将主产品和异构体分别进样分析,保留时间是基本一致,由此基本可以确定异构体没有分离出来。

    之后调整流动相的各种比例,效果不是很理想。后来将流动相的缓冲盐更换为磷酸二氢钾,见下图,效果还是不行。

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  • huaibeijiayuan

    第2楼2011/09/23

    因为手边色谱柱不是很多,再说自己单方面摸索时间也耗得比较久,于是就寻求色谱柱厂家的帮助,国产色谱柱厂家与月旭公司比较熟悉,就咨询月旭公司的应用工程师,将相关资料与工程师沟通后,月旭工程师推荐了一款苯基柱,PFP-C18250mm*4.65um色谱柱。当时就申请试用,第三天就收到了这款色谱柱,方法基本没有都大的变化。

    分析条件:

    色谱柱:上海月旭公司的PFP-C18色谱柱;250mm*4.6mm5um

    梯度方法:流动相:A/B=ACN/0.1%磷酸二氢钾 恒流(见图2



    从这张谱图看,异构体能明显分离出来,但分离效果不是很理想,并且保留时间接近20min了,如果要达到足够的分离,必须增加水的比例,但这样造成的后果是保留时间更长,分析时间太长对于生产控制来说绝对不是一个很好的分析方法,所以最终放弃了。

    再次与月旭工程师联系后,工程师推荐了另一款LP-C18色谱柱,250mm*4.6mm5um于是继续申请试用。

    在接到试用的色谱柱后,按照原有的方法进行了摸索。这是分析的谱图,(图3)样品按照1:1的比例,基本达到了基线分离,再说实际生产的样品,异构体的比例不可能有这么多,正常的反应粗品异构体含量一般在5%以下,因此完全可以达到控制要求,分析时间相对来说也不是很长,于是基本决定选用这根色谱柱了。

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  • huaibeijiayuan

    第3楼2011/09/23

    最后所要做得就是在此基础上对方法进行进一步优化,这是优化后的样品分析谱图。(图4)当然这个方法可能不是最好的,但目前来说是个比较适合的方法。13.28min的组份就是我们所需用监控的异构体。




    通过这次一波三折的方法调试,告诉我们:对一个产品的方法开发,首先需要查找相关资料,如果有现成的分析方法,我们会减少很多的调试时间;如果查找不到只能依靠自己的摸索,对于HPLC来说,关键在于确定检测波长,组分的分离度主要靠色谱柱的选择,这就相对比较简单了;在摸索过程中一定不要忘记寻求专家的帮助,特别是色谱柱生产厂家的工程师帮助,对于一个工厂来说,选择色谱柱的空间相对来说比较狭小,但对于生产厂家来说,选择的范围就扩展了很多,同时这些工程师的分析经验也是比较丰富,能帮助你减少很多的弯路。

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  • light2357302

    第4楼2011/09/24

    这对于我们开发分析方法很有借鉴意义

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  • sanbu830317

    第5楼2011/09/25

    我们一个手性化合物自己一直搞不定,后来交给大赛路很快就有结果了。

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  • huaibeijiayuan

    第6楼2011/09/25

    因为生产厂家大多有产品库,结构相似的,分析方法也比较接近。

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  • fengmo4668

    第7楼2011/09/26

    淮北的工作站是N2010吗?

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  • huaibeijiayuan

    第8楼2011/09/26

    不是N2010,是福立的工作站

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  • 儒雅凤

    第9楼2011/09/26

    手性样品的分离能够做到这样,不错了。

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  • chenyujie

    第10楼2011/09/28

    楼主做的值得借鉴 谢谢您的分享 呵呵

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