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溶剂造成柱效下降和峰分叉原因解析

liufeilzu

2011/09/24

液相色谱（LC）

溶剂造成柱效下降和峰分叉原因解析

柱效下降是坛子里大家反映仅次于压力问题的第二大问题了，在这里我们通过实例看一下溶剂造成的柱效下降和峰分叉的现象，并尽可能解释这些现象。柱效下降的表现一般是峰变宽和峰高下降，有的时候会出现分叉峰。造成柱效下降的原因很多，很多时候我们会想到柱子的问题，其实溶剂与流动相的不匹配会造成柱效下降。

1实验

仪器：高效液相色谱配自动进样器，UV/vis检测器；安捷伦ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱，4.6×250mm，5μm。

试剂：分析物F（易溶于甲醇和冰醋酸，微溶于乙醇和水，进样用80%的甲醇溶解），磷酸二氢钠（分析纯），乙睛（色谱纯），甲醇（分析纯）。

检测条件：检测波长214nm，缓冲溶液0.01M磷酸二氢钠缓冲溶液；流动相：乙腈：缓冲盐=15:85。进样体积：100μl。

如图1，在缓冲溶液pH =5.0时出现分叉峰（图1），样品F浓度为2μg/ml。下调缓冲盐pH =3.0，仍然出现分叉峰（图2）。

图1. pH =5.0 色谱图。

图2. pH =3.0 色谱图。

同时我们发现所有的杂质峰也都出现了分叉情况（图3）。

图3. 杂质峰也出现分叉。

2原因分析。

是什么原因造成了这种现象呢？

首先想到的是大体积进样造成的（因为进样20μl不能检测到所分析物质F浓度）进样100μl一般会造成峰扩展，柱效下降，如果降低进样量还会出现分叉峰吗？实验结果如图4。进样体积减小，峰分叉的情况逐渐改善，在进样50μl的情况下，形成了肩峰（图4小图），进样40μl肩峰消失。一般来说，加大进样体积，峰会展宽很多，分离度降低，柱效下降（极端情况下如果是微柱或者UPLC会看不到峰），不会出现峰分叉，分叉峰是怎么形成的呢？更奇怪的是进样体积越大，出峰时间越靠前，在进样100μl和进样20μl的情况下，出峰时间相差4分钟，为什么进样体积会影响出峰时间？

图4依次进样20,40,50,80,100μl的色谱图。小图为50μl进样后积分，该图显示色谱峰有肩峰。

造成这些现象的原因只有一个：溶解分析物F的溶剂，增加进样体积只是放大了溶剂影响。在我们的实验中，溶剂采用80%的甲醇溶解，而流动相是15%的乙腈，在反相色谱中，80%的甲醇洗脱能力强于15%的乙腈，就是说溶解F的溶剂极性小于流动相的极性。当样品进入色谱后，一部分分析物质会和固定相结合，一部分还没有和固定相结合就被洗脱能力强的溶剂带着沿流动方向移动（色谱柱纵轴），这样分析物就发生了扩散（图5扩散），当进样体积加大，进入色谱系统的溶剂会改变色谱柱的流动相组成，甚至会顶替掉流动相（图5溶剂替代），在溶剂的洗脱下，出峰时间就会提早，溶剂里的分析物F和在色谱过程开始的与固定相结合的分析物F会先后流出，这样就形成了分叉峰（图5检测）。

图5.溶剂造成的峰扩散和峰分叉过程。橘黄色为溶剂，黑色为分析化合物，淡蓝色为色谱。

3结论

1溶解分析物的溶剂最好使用流动相或者洗脱能力比流动相小的溶剂，避免峰展开。

2考虑到分析物溶解性，如果选用洗脱能力比流动相强的溶剂，尽量减小进样体积，避免对色谱造成大的扰动。

3 如果目标是能检测2μg/ml的浓度，而现有分析方法的定量限LOQ是10μg/ml，请慎重使用加大进样量的改进方法，加大进样量会产生很多意想不到的问题，结果通常是进样量加大5倍，LOQ一般不会提高5倍（可惜有些领导不这么想）。

分
该帖子已被版主-zhaohua8011加3积分，加2经验;加分理由:鼓励

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sanbu830317

第1楼2011/09/25

楼主讲的好详细啊，好像这个现象专业术语叫“沟流”。

0

liufeilzu

第2楼2011/09/25

谢楼上提供意见。好像“沟流”指的是流固系统中一条传质阻力很小的“沟”，化工中精馏塔会遇到这个，所以精馏塔每隔一段会有收集板。高效液相色谱的沟流好像和溶剂效应不是一回事,你说呢？

0

nnsss

第3楼2011/09/26

溶剂强度大,一般峰型变差,不致分叉,分叉原因多于柱塌陷

0

zhangpeter12

第4楼2011/09/27

楼主见解非凡！俺虽然也碰见认识过此现象：“溶剂有时候会由于和流动相不适合而造成峰变形分叉，柱效降低”！但不能从理论上知其所以然！今读楼主这稿文章，才知其原因！谢谢分享。

0

小不董

第5楼2011/10/06

应助达人

增加进样量出现楼主的色谱峰变形,为什么不会是柱子过载引起的呢?

0

liufeilzu

第6楼2011/10/06

柱子过载只是一小部分原因，注意色谱图在50到100的进样体积时候峰高并没有增加，而且峰高很小，峰前沿甚至出现了一个分叉的峰，而且进样体积越大保留时间越小，这是溶剂改变了流动相，局部提高了洗脱能力！如果是柱过载，一般我们见到的是峰起点时间几乎不变，也不会保留时间缩短，但是峰有拖尾情况

1

洽洽哈哈

第7楼2015/10/12

原来是这么回事，最近用乙腈做溶剂，进样量一增大色谱峰就裂分了

1

hujiangtao

第8楼2015/10/12

应助达人

原来色谱峰分叉还有这么多学问受教了

0

p3251257

第9楼2017/07/25

连续进样分离度逐渐下降也是这样的么

0

p3251257

第10楼2017/07/25

连续进样分离度逐渐下降也是这种原因么-应该减小进样量么

0

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