【第四届原创】《扇贝柱中多种磷酸盐的离子色谱同时测定》

hhciq

2011/11/25

私聊

食品添加剂

扇贝柱中多种磷酸盐的离子色谱同时测定

摘要：本文建立了一种简单、快捷的离子色谱测定扇贝柱中多种磷酸盐的方法。采用超声提取、固相萃取柱净化的方法对样品进行前处理，高容量阴离子交换色谱柱分离，抑制性电导检测器检测。讨论了不同实验条件对多种磷酸盐加标回收率的影响。实验证明：该方法简便、快捷，选择性好，灵敏度高，无污染、操作步骤简单等优点。磷酸盐、焦磷酸盐、三聚磷酸盐、三偏磷酸盐的检出限分别为2.0 mg/L、0.5 mg/L、0.5 mg/L、0.5 mg/L，回收率均在75 %以上，相对标准偏差（RSD）小于10 %。实际样品检测结果令人满意。

关键词扇贝柱；磷酸盐；离子色谱

中图分类号：O 657.7 文献标识码：A 文章编号：

Abstract：This paper establishes a simple and rapid method for determination of various phosphate. The samples were pre-treated by ultrasonic extraction,h

Keywords：Scallop；polyphosphate；Ion chromatography

多种磷酸盐作为重要的食品添加剂，被广泛应用于食品生产的各个领域。在食品中添加这些物质有助于改善食品的色、香、味、形，并保持食品的新鲜度和质量，还可作为水保持剂、品质改良剂、pH调节剂和金属螯合剂等[1]，但是人体过多地摄入磷酸盐则会降低钙吸收，导致肌体钙磷失衡，继而引发疾病[2]。针对这种情况一些不法商贩为了增加海产品中的重量来获取更多的商业利润，向水产品中人为注水，在提高利润的同时来损害消费者的利益[1]。目前，我国食品添加剂超标使用安全问题十分突出。欧盟食品和饲料快速警报体系RASFF对中国出口海产品中多聚磷酸盐超标行为进行了多次的通报[3]。因此建立一种较适宜检测海产品中多种磷酸盐的方法是目前亟需解决的问题。

在2003年前，欧盟和日本只要求检测磷酸盐总量，2010年后，欧盟要求进行磷酸盐具体成分限量[4]。目前，常用检测多种磷酸盐的方法有薄层层析法[5]、核磁共振法[6]、离子色谱法[7][8]等。薄层层析法重现性较差, 核磁共振法操作繁琐，给检验工作带来许多麻烦。离子色谱法是利用离子交换的原理，可以连续对多种无机阴离子或亲水性的有机阴离子进行定性和定量分析，应用越来越广泛[9]。而文献[7][8]方法没有测定扇贝柱中4种磷酸盐的检测方法。新方法使用高温热水使样品中酶失活，超声助溶后，用高速离心和微孔滤膜去除蛋白干扰，阴离子交换分离，经抑制型电导检测器进行检测。与文献[7][8]相比，前处理方法采用物理分离技术，方法简单、回收率稳定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

所用试剂均为色谱纯或优级纯。实验用水为GB/T6682规定的一级水规定，电阻率大于或等于18.2 MΩ.cm；氢氧化钠（优级纯）；磷酸钠、焦磷酸钠、三聚磷酸钠、三偏磷酸钠标准试剂。

ICS-3000型离子色谱系统（Dionex公司），ASRS型抑制性电导检测器，AS11A-HC阴离子分析柱、OnGuard RP柱、OnGuard Ag柱和OnGuard Na柱（美国Dionex公司产品）、均质器、高速离心机、超声波清洗器、容量瓶、50 mL具塞塑料离心管。

1.2 色谱条件

色谱柱：Dionex IonPacAS11-HC4mm×250mm；进样量：50 µL；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ºC；电导检测池温度：35 ℃；淋洗液：氢氧化钠溶液，浓度为35～70 mmol/L；洗脱梯度为：35 mmol/L，9 min；70 mmol/L，16 min；35 mmol/L，5 min；

1.3 样品前处理

扇贝柱样品均质后称取5 g（精确至0.01 g）于100 mL容量瓶中，加入80 mL的热超纯水，于90 ℃水浴锅中水浴8 min，然后放入超声波中提取8 min，用氢氧化钠溶液调节其pH值至9.0～10.0，用超纯水定容至100 mL。经14000 r/min下，离心时间6min；取上清液依次过0.22 μm水性滤膜、OnGuard RP柱，滤液供离子色谱进行检测。

空白试验：除不称取试样外，均按上述步骤同时完成空白试验。

1.4 测定

配制一系列浓度的磷酸钠、焦磷酸钠、三聚磷酸钠和三偏磷酸钠混合标准工作溶液，在最佳实验条件下制作标准曲线。采用外标法定量，以峰面积为纵坐标，待测物的质量浓度为横坐标。四种磷酸盐的线性方程、线性范围、线性相关系数R²见表1、标准溶液色谱图见图1.

表 1. 多种磷酸盐的线性方程

Analyte 线性方程线性范围（mg/L）确定系数 R2linear equation Range（mg/L ） relativity R2

磷酸钠 Y=0.065 X+0.057 2.0 ～ 250.0 0.9999焦磷酸钠 Y=0.083 X-0.014 0.5 ～ 50.0 0.9999三聚磷酸钠 Y=0.080 X-0.013 0.5 ～ 50.0 0.9997三偏磷酸钠 Y=0.077 X-0.001 0.5 ～ 50.0 0.9996

表1数据表明，磷酸钠、焦磷酸钠、三聚磷酸钠、三偏磷酸钠在样品中的添加水平范围内，响应值在仪器线性范围之内，且线性关系良好。根据最终样液所代表的试样量、定容体积、进样量和进行测定时所受的干扰情况，考虑到实际工作需要，确定本方法的检出限(LOD)为磷酸钠2.0 mg/kg，焦磷酸钠0.5 mg/L、三聚磷酸钠0.5 mg/L，三偏磷酸钠0.5 mg/L。

图1. 四种磷酸盐的标准溶液色谱图

2　结果与讨论

2.1 温度对纯水中多种磷酸盐降解的影响

多聚磷酸盐在水中不稳定，高温或酸性条件下可能使多聚磷酸盐解聚。由此考察温度对多聚磷酸盐影响。在100 ml容量瓶中加入20 mg/L的混合标准溶液，然后再分别加入80 mL20 ℃（室温）、60 ℃、80 ℃的超纯水。结果如图2所示。

该结果表明，不同温度的热水对多种磷酸盐的回收率没有明显差异，即高温热纯水对多种磷酸盐的降解没有明显影响。

图2 温度对多聚磷酸盐的影响

2.2 样品中酶对多种磷酸盐降解的影响

向称取均质扇贝柱样品的容量瓶中加入100 mg/L的磷酸钠，20 mg/L的焦磷酸钠、三聚磷酸钠、三偏磷酸钠标准混合溶液，然后加入不同温度（20 ℃、60 ℃、80 ℃）的超纯水，以此来考察样品中是否存在某种酶对多种磷酸盐具有降解的影响因素。实验结果见表2。

表2 样品中对多种磷酸盐降解的影响

Analyte 20℃ 60℃ 80℃测量值(mg/L) 回收率（%）测量值(mg/L) 回收率（%）测量值(mg/L) 回收率（%）

磷酸钠 100.04 100.04 97.37 97.37 89.07 89.07 焦磷酸钠 15.30 76.50 6.32 81.58 18.66 93.32三聚磷酸钠 17.87 89.37 18.07 90.34 18.30 91.50三偏磷酸钠 19.85 99.25 19.98 99.92 19.82 99.09

由表3的数据显示，向具有扇贝柱样品的容量瓶中加入不同温度的热超纯水，其对各种磷酸盐具有不同程度的影响。在表中可以看出，焦磷酸钠、三聚磷酸钠随着加入热超纯水温度的升高其回收率是逐渐增加；而磷酸钠随着加入超纯水温度的升高其回收率是逐渐减少的；而对三偏磷酸盐的影响差异不显著；由此分析得出，扇贝柱样品中本身存在一种酶对焦磷酸钠、三聚磷酸钠在低温下都有不同程度的降解，使得磷酸钠的回收率有着明显差异。所以采用高温的热超纯水可以使样品中存在的酶进行灭活，可以消除对结果造成的影响。

2.3 离心时间对多种磷酸盐降解的影响

经称取样品、加标、酶灭活、超声提取、固相萃取净化，考察了不同离心时间对样品中多种磷酸盐实验测定的影响。在14000 r/min条件下，设定离心时间

分别为6min、15min。结果见表3

表3 离心时间对多种磷酸盐降解的影响

Analyte	6 min 测量值(mg/L) 回收率（%）		15 min 测量值(mg/L) 回收率（%）
磷酸钠	100.31	101.31	100.04	100.04
焦磷酸钠	18.44	89.37	15.81	76.18
三聚磷酸钠	20.22	101.10	19.43	97.18
三偏磷酸钠	21.01	101.86	20.57	99.63

从表3中可以得出，焦磷酸钠离心时间为6min时，其加标回收率为89.4%；离心时间为15min时，加标回收率为76.2%。而从其他三种磷酸盐的回收率的数据观察，离心时间对其三种磷酸盐几乎没有影响。由此可见离心时间对焦磷酸钠的加标回收率影响较显著，随着离心时间的延长，其加标回收率是逐渐降低的。分析原因可能是长时间离心造成大分子变性蛋白质的聚合，将部分焦磷酸钠一同沉淀所致。而对其他三种磷酸盐的影响较小。所以本方法选择离心时间为6 min。

2.4方法的回收率和精密度

用样品扇贝柱作为基质进行加标回收和精密度实验。样品中分别添加标准使用液至样品含量（见表4）后，摇匀，使标准样品充分吸收，然后按上述中样品前处理方法进行提取、净化、测定，其回收率和精密度见表4。

表4．添加回收率与精密度实验数据(n=3)

Analyte 加标浓度（mg/kg）平均值（mg/kg）相对标准偏差（%）平均回收率（%）

磷酸钠 100.0 141.0 10.0 141.0200.0 253.7 4.1 126.8400.0 434.4 10.7 108.61000.0 1133.5 3.6 113.4 焦磷酸钠 25.0 27.0 1.5 108.050.0 43.2 9.2 86.4100.0 79.2 3.2 79.2200.0 149.7 5.3 74.9三聚磷酸钠 25.0 27.6 2.8 110.450.0 42.2 1.7 84.3100.0 83.8 1.2 83.8200.0 171.3 0.8 85.7三偏磷酸钠 100.0 96.4 1.5 96.4200.0 188.8 1.4 94.4400.0 380.0 1.6 95.01000.0 929.0 1.2 92.9

由表4中的添加回收率实验数据可以看出，本方法磷酸钠100.0 mg/kg～1000.0 mg/kg、焦磷酸钠25.0 mg/kg～200.0 mg/kg、三聚磷酸钠25.0 mg/kg～200.0 mg/kg及三偏磷酸钠100.0 mg/kg～1000.0 mg/kg范围的浓度添加，其回收率数据全部在74.9%～141.0%之间，相对标准偏差在0.8%～10.7%之间；说明方法的回收率良好，完全可以满足日常分析的要求。

3 结论

本文采用超声提取、高速离心分离、固相萃取柱净化，高容量阴离子交换色谱柱分离，抑制性电导检测器的离子色谱法进行检测，外标法定量，实现了水产品中多聚磷酸盐快速简便、灵敏度高、重复性好的检测要求。

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hhciq

第1楼2011/11/25

请斑竹帮忙，将格式整理一下吧。谢谢。

另外，也请各位大虾指点指点，毕竟磷酸盐类的个别检测还有不完善的地方。
titi特意提醒我赶快将以前修复的文章返回去各位也多有关照。
这个文章在几个月前基本成型，没有时间仔细修正。
为表示各位对我支持的感谢，看到食品版块的文章还不多，就匆忙在此发出，错误之处，请大家斧正。谢谢！

也以这篇文章感谢我在去年遇到问题时候，各位大虾热心的支持（http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20110314/3175820/index.shtml）。
不管怎么折腾，戴安客服的刘主任（多次联系，也不知道是谁。后来维修工程师告诉我的，当时我很着急，语言有些唐突，歉意）、刘工、齐工及技术中心的李主任、郑工等努力下，终于解决了，现在一年了，没有什么问题。解决的方式是接了一个二氧化碳捕获柱子。只是，原因我还是不明白。

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凯子蒸包子

第2楼2011/11/25

谢谢对本版块的支持！
修改后是否可以投稿？咱们原创大赛有核心期刊支持的。

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hhciq

第3楼2011/11/25

楼上是斑竹吗？

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凯子蒸包子

第4楼2011/11/25

有几个问题想讨论一下：
1.容量瓶是不能用来加热的，是否需要改用其它器皿溶出，之后再用容量瓶定容。
2.大部分回收率都不错，但有一个141%，审稿的老专家恐怕会比较纠结这个问题。

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hhciq

第5楼2011/11/25

1、按道理是这样的。实际工作确实有这样作的，还是有缺陷，应该注意。

2、那是磷酸盐的回收率，我能做到这个，说实话，已经很费劲了。因为其它三种降解后的产物就是磷酸盐。如果关注一下磷酸盐类的多种检测文献，很多都回避了磷酸盐这个项目，原因可能就是前面的问题。

3、斑竹，加我好友。我把全文传给你，帮助整理一下。谢谢1