求指教：高效液相色谱法测维生素D3不稳定

您方便将国标贴出来吗，大家也好帮着分析一下？

我是参考国标GB5413.9-2010。实验过程没有问题，因为以期做的都正常，就是最近一段时间总出问题。一个样品要净化2~3次，才合格，不知道是净化有问题还是定量有问题。

正己烷：环己烷：异丙醇=1:1:0.8%。
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这个，按标准应该是50:50:0.8%，没配错吧？

贴出来大家分析一下：

6.4.2 维生素D 的测定
6.4.2.1 维生素D 待测液的净化
6.4.2.1.1 色谱参考条件。
色谱柱：硅胶柱，150 mm ×4.6 mm，或具同等性能的色谱柱。
流动相：环己烷（4.9）与正己烷（4.8）按体积比1：1混合，并按体积分数0.8 %加入异丙醇（4.3）。
流速：1 mL/min。
波长：264 nm。
柱温：35 ℃ ±1 ℃。
进样体积：500 μL。
6.4.2.1.2 取约0.5 mL维生素D3标准储备液（4.11.4）于10 mL具塞试管中，在40 ℃±2 ℃的氮吹仪（5.4）
上吹干。残渣用5 mL正己烷振荡溶解。取该溶液50 μL注入液相色谱仪中测定，确定维生素D保留时间。
然后将500 μL待测液（6.3.3中B管）注入液相色谱仪中，根据维生素D标准溶液保留时间收集维生素D
馏分于试管C中。将试管C置于40 ℃±2 ℃条件下的氮吹仪中吹干，取出准确加入1.0 mL甲醇（4.7），残
渣振荡溶解，即为维生素D测定液。
GB 5413.9—2010
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6.4.2.2 维生素D 测定液的测定
6.4.2.2.1 参考色谱条件
色谱柱：C18柱，250 mm ×4.6 mm，5μm，或具同等性能的色谱柱。
流动相：甲醇（4.7）。
流速：1 mL/min。
检测波长：264 nm。
柱温：35 ℃ ±1 ℃。
进样量：100 μL。
6.4.2.2.2 标准曲线的绘制
分别准确吸取维生素D2（或D3）标准储备液（4.11.3、4.11.4）0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、
1.00 mL 于100 棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为0.200 μg/mL、
0.400 μg/mL、0.600 μg/mL、0.800 μg/mL、1.000 μg/mL。
分别将维生素D2（或D3）标准工作液注入液相色谱仪中，得到峰高（或峰面积)，参见附录B。以
峰高(或峰面积)为纵坐标，以维生素D2（或D3）标准工作液浓度为横坐标分别绘制标准曲线。
6.4.2.2.3 维生素D 试样的测定
吸取维生素D测定液（6.4.2.1中C管）100 μL注入液相色谱仪中（色谱图参见附录B），得到峰高（或
峰面积），根据标准曲线得到维生素D测定液中维生素D2（或D3）的浓度。
维生素D 回收率测定结果记为回收率校正因子f，代入测定结果计算公式（2），对维生素D 含量
测定结果进行校正。

样品不稳定或者仪器的问题，进样采集不准确！

不知道这个问题解决没有，也遇到同样的问题，不知道怎么解决！！

VD要避光 也怕热 而且在空气中容易氧化 我觉得这些点要注意

彻底清洗系统，再试试

1.    要加维生素C抗氧化。
2.    要避光。
3.    加入维生素D2作内标。