省部重点实验室
第1楼2012/03/02
1. 波分复用共焦显微镜
波分复用共焦显微镜主要是通过不同波长的光聚焦在样品中会形成不同的聚焦深度,同时反射光也具有不同的波长,这样来提高显微系统的分辨率和成像速度,从而改善系统的性能。图2是波分复用成像系统示意图:
图2波分复用共焦显微镜系统示意图
在图2中,通过使用一个波长空间编码/解码器,输入的不同波长的超白光聚焦在样品的不同空间位置上,就形成了在样品上的多点聚焦。反射光通过同一个编码/解码器被重新准直,然后经过空间滤波,最后通过检测反射光和空间滤波光的光谱,得到一个样品阵列点的图像。波分复用显微成像技术能够有效地抑制不同点之间的串扰,并且波分复用技术把三维扫描问题降为二维的。该系统可以达到4nm的成像深度的变化,横向扫描范围达到了130µm。2006年美国的Kebin Shi等人提出使用超连续谱的波分复用共焦显微成像系统,通过优化探测孔径,可以得到0.75µm的轴向分辨率和80%的探测效率,能够实现波长范围为500nm到700nm的波段探测,并可以达到每像素3. 25nm的深度灵敏度。
① 光谱编码共焦显微镜
在光谱编码共焦显微镜中也使用了波分复用技术,通过一个透射光栅把不同波长的光指向不同的横向位置,并对从样品反射回来的一维空间信息进行编码。该系统使用输出功率为470µW、中心波长为940nm、带宽为75nm的超辐射发光二极管作为光源,这种共焦显微镜能够提供保证人体组织无运动伪影成像,还可以保持足够小的尺寸以纳入小直径导管或者内窥镜中进行体内生物医学研究。2005年麻省理工学院的C.Boudoux等人在光谱编码共焦显微镜中使用一个快速波长扫描源(a rapidwavelength swept source)进而获得了一个30帧/s的大视场成像,系统的横向和轴向分辨率分别为1.4µm和6µm,对人体皮肤的成像深度可达350µm,并能对细胞和亚细胞进行实时观察。
②使用波分复用技术的双光子荧光显微镜
波分复用技术以前主要应用在反射型共焦显微镜中,这限制了其在生物学中的应用,因此2006年宾夕法尼亚州立大学的K. Shi等人提出把波分复用扫描技术应用于双光子荧光成像系统。通过频分复用技术的应用,双光子荧光显微系统的扫描范围能达到100µm。
2. 频分复用共焦显微镜
频分复用荧光共焦显微镜是把频分复用技术应用到荧光共焦显微镜中,通过对激光光源进行分光调制,然后再对收集到的荧光进行解调来实现对样品的三维观测的。这样可以实现无扫描多点多通道同时探测,降低了观察时间,提高了检测效率,增强了系统的性能。
图3所示是一个频分复用双通道荧光共焦显微镜系统原理图。
首先,激励激光束被分光棱镜BS1分成了两光束,它们经过光斩波器分别被调制到不同的载波频率,记ω1=πf1 和ω2=πf2。然后,调制后的两束光再通过分光棱镜BS2后合并在一起,再通过分光棱镜BS3,使两束被调制的光束以微小的角度变化通过物镜,耦合到物镜的后孔径光阑,并在物镜后方的样本上呈现出两个聚焦点(可以通过调整平面镜Ml和M2的反射角来调整两束入射光束的相对角度来改变两点之间的距离)。样品在这两个聚焦点被激发产生荧光,荧光被物镜聚焦后再通过分光棱镜BS3反射到分光棱镜BS4(BS4的作用是为了可以同时观察像面和两亮点的位置所在)。光信号通过BS4后,一部分光束被物镜成像后通过CCD接收传送到计算机上,而另一部分光经过滤波器滤除了干扰光线,只传送荧光。最后,两路荧光通过单模光纤被合并后传送给光电倍增管PMT,通过PMT的光电转换,再经过数据采集,在计算机中进行傅里叶变换处理就得到观测结果。
图3频分复用双通道荧光共焦显微镜工作原理图
目前宾夕法尼亚州立大学的Shizhuo( Stuart)Yin教授课题组已经完成了双通道双频复用的荧光共焦显微镜的生物细胞钙离子浓度实时测量实验。该系统完成了在心肌细胞激励收缩过程中的双荧光点钙离子分布,系统横向和轴向分辨率达到200nm和100nm.时间分辨小于1ms,而且已经实现两点荧光同时跟踪。
在研究中,我们提出使用一种新型的光电材料一聚合物分散液晶( PDLC)制备的聚合物分散液晶全息光栅( H-PDLC)阵列代替光斩波器对激励激光进行调制,因为PDLC具有在电压驱动下透过性会发生改变的电光性能,可以实现对多束激光的实时快速调频,改善了系统性能。用体全息光路制作的聚合物分散液晶材料体全息光栅,空间频率和衍射效率可以做到很高,衍射特性电场可调,且具有开关响应速度快的特点。特别是在多路频分复用显微系统中,H-PDLC电控衍射阵列更能体现出自身的优势,例如设计8路频分复用时,一般需要8个斩波器,而采取HPDLC衍射阵列只需一个2×4的阵列就可以办到。
H-PDLC阵列作为频分复用荧光共焦显微技术中的光斩波器,具有无机械运动部件、速度快、易于集成和小型化等优点;在全息光路中采用逐次掩模曝光的手段制作的H-PDLC电控衍射阵列,能实现对多束激光的实时快怏速调频,克服频分复用荧光显微系统的局限,加速系统性能的改善。
三、结论
近年来,科学家为了提高共焦显微镜的分辨率对显微成像系统进行了光源、探测器孔径等多方面的优化和改善并不断研究提高成像速度的新方法,分辨率和成像速度的提高使共焦显微镜在生物医学、微电子制造、材料科学和精密测量等领域都有了更广泛的应用。随着共焦显微成像技术会与更多新的技术相结合,共焦显微镜的信噪比和成像质量将得到更大改善,为了能更好地进行体内观测,共焦显微镜也有向小型化发展的趋势。另一方面,有时在分辨率的提高和成像速度的改善之间会有矛盾,因此就需要发展能够兼顾两方面的技术,这是以后研究的一个方向。总之,科学技术的发展必定会促进共焦显微成像技术迈向新的高度,必将推动人们对生命科学进行更深入的研究和探索。