茚三酮分光光度法分析甘氨酸

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应助达人

说说样品的制备过程

茚三酮显色法测定氨基酸的含量

一．原理：　凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。

二．仪器：721型分光光度计　台天平 减压蒸馏器 干燥 容量瓶 移液枪　烧杯 试管架 试管 水浴锅。
三．药品：
（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3mmol/L 溶液
（2）pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L乙酸混合而成。用pH 检查校正。
（3）茚三酮显色液：称取170mg 茚三酮和30mg 还原茚三酮，用20mL 乙二醇甲醚溶解
（4）60％乙醇。（5）样品液：每毫升含0.5～50μg 氨基酸。
茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入0.25g 活性炭，轻轻搅拌。加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。
还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g 茚三酮，用12.5mL 沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将0.5g 维生素C 用25mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。
乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。

四、操作步骤
1．标准曲线的制作
分别取0.3mmol/L 的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于试管中，用水补足至1.0mL。各加入1.0mL pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液；再加入1.0mL 茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min 后，加入3.0mL 60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。以OD570nm 为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。
序 号    1    2    3    4    5    6
0.3mmol/L标准氨基酸溶液，mL    0    0.2    0.4    0.6    0.8    1.0
蒸馏水，mL    1.0    0.8    0.6    0.4    0.2    0
2mol/L醋酸缓冲液，mL    1    1    1    1    1    1
茚三酮显色液，mL    1    1    1    1    1    1
OD570                       
2．氨基酸样品的测定
取样品液1.0mL，加入pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液1.0mL 和茚三酮显色液1.0mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15min，自来水冷却。放置5min 后，加3.0mL 60％乙醇稀释，摇匀后测定OD570nm（生成的颜色在60min 内稳定）。将样品测定的OD570nm 与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。