RT-PCR反应过程与体系简历

逆转录合成 cDNA

反应体系如下

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MgCl2
2μl


10×RT Buffer
1μl


RNase Free dH2O

3.75μl


dNTP Mixture(各10mM)
1μl


RNase Inhibitor
0.25μl


AMV Reverse Transcriptase
0.5μl


Random 9 mers

0.5μl


Positive Control RNA (1μg)
1μl

混匀快速离心一次

反应条件如下

30℃
10min

42℃
30min

99℃
5min

5℃

5min

-20℃ 冰箱冻存



PCR反应

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摸板cDNA
2.5μl


5×PCR Buffer
2.5μl

灭菌蒸馏水
7.2μl

聚合酶 Ex Taq HS
0.1μl

上游引物
0.1μl

下游引物
0.1μl　

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　Total
12.5μl

混匀快速离心一次

反应条件

94℃
2min
1Cycle

94℃
40sec
┓


50-65℃
40sec
┃
25-35Cycles

72℃
1min
┛

72℃

5min
1Cycle


PCR产物-20℃冰箱保存

取PCR产物8μl　加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V


100mA 30min
溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果