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新型键合材料(amide)在分离小核酸中的应用

  • gaoshan_lanjing
    2012/09/28
    食品检测
  • 私聊

液相色谱(LC)

  • 键合硅胶基质的正相色谱在分离小核酸中的应用

    小核酸异构体的纯化通常是用正相硅胶或者反相C18C8。这两种模式都有它的缺陷:反相的分离度比较好,但相比正相,它的上样量较小,且后处理中,由于流动相中大量水的存在,导致旋蒸会比较麻烦,甚至会出现温度过高或者处理时间过长而使样品变质的情况;纯硅胶的正相色谱,尽管比较便宜,但由于小核酸的极性较大,导致固定相对样品的西服严重,回收率比较低,而且硅胶不能多次利用,所以,换来换去的,人力成本也是很贵的。用酰胺键合硅胶作为正相色谱固定相,综合了硅胶和反相C18/C8的优势:具有特殊的立体选择性,对小核酸异构体的分离较好,极性较硅胶弱,解决了由于吸附造成的低回收率问题,而且它可以反复使用数百次,所以用这种填料分离纯化小核酸,优势明显。







    下面是小核酸在结构修饰过程中,产生的几种异构体:

    2’-BaG
    3’-BaG Dimer-BaG

    2’-BaG 是目标物,占到30-40%,几种异构体的性质差别不大,分离比较有难度。用硅胶柱,过柱需要10个小时,回收率不到40%,装柱和卸柱一次需要7个小时,所以使用成本还是很高的。反相色谱,后期除水的旋蒸温度要超过50℃,样品很容易在这个温度变质。用键合硅胶(amide),上样量、回收率、纯度、样品分离时间和后处理都表现不俗。

    下图是反相色谱的分析图谱:

    Figure 1 the sample analysis chromatogram used column Venusil® XBP C18
    L(4.6×250 mm5 μm150Å)Elution condition was the mixture of 0.03%TFA and CAN(25:75)wavelength was 254 nm and flow rate was 1ml/min with 35℃ column temperature

    制备时就用到了我们的amide

    Venusil® Hilic Flash柱(120g20-45μm 100Å) 流动相用正己烷混合乙酸乙酯(2:8),分离可以在两个小时内解决战斗,上样量为2.5g, 三种异构体得到了很好的分离。


    Figure 2 The sample preparation chromatogram used column Venusil® Hilic, and used normal phase chromatographic mode, 3 isomers separated very well.




    纯度检测:

    30℃下,馏分用旋蒸蒸干,得到粉末0.61g,回收率为74%,纯度超过98%


    Figure 3 2’-BaG detection by reverse phase analysis chromatogram

    Conclusions

    2’-BaG这样的小核酸可以用酰胺键和硅胶很好的实现分离,上样量、回收率、分离周期、后处理等方面,能够取得比正相硅胶或反相C18/C8等更好的分离效果,我们可以尝试分离更多的小核酸。
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  • 有水有渝

    第1楼2012/09/28

    应助达人

    酰胺键合硅胶与普通的氨基柱与氰基柱有什么优势没有?除了性能,价格方法有优势吗?

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  • 小不董

    第2楼2012/10/05

    应助达人

    色谱中的峰分别对应什么物质没标示出来,需猜测哟,纯度检测用的色谱柱和分析的柱子也是一个吗?看起来不像

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  • jianzhu_zhang

    第3楼2012/10/18

    有个疑惑:
    你的反相分析上明显的目标物有3个,为什么使用HILIC后就出现4个峰呢?而且未标明目标物是哪个。

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  • gaoshan_lanjing

    第4楼2012/11/04

    回复有水又渝:
    酰胺键合硅胶可替代大部分的氨基柱的分析或分离的应用,但相对氨基柱更加稳定,流动相中允许水的比例大幅度提高,甚至可以到纯水做流动性;寿命根据使用,可以达到数百次;腈基柱的使用范围比较窄,不太常用,所以不太好说他们的对比结果。价格的话,需要咨询厂家了,应该会贵一点儿。

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  • gaoshan_lanjing

    第5楼2012/11/04

    回复小不董:
    抱歉,帖子写得确实很粗,制备中的34min、59min的两个峰,应该对应的是分析中的10min、13min两个峰;且目标峰是34min的那个。不是靠猜,其实分离中得到的是5个峰。3min、5min、15min、34min和59min。分别作了液相的检测;分析图中其实还有一个小峰在24min的,其实也是一个干扰物,就是dimer的那个峰。在正相中出在5min的位置,和另一个杂质分析图上3min的峰出在一起了。

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  • gaoshan_lanjing

    第6楼2012/11/04

    回复jianzhu_zhang:
    其实分析比较明显的峰是5个,分别是:3min、4min、10min、13min和24min;制备中比较明显的峰是4个;原因是分析中的3min和24min的峰在制备中,叠加在一起了,出在5min。

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  • houjjun

    第7楼2012/11/04

    一般的客户都关心性能、价格和寿命

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  • gaoshan_lanjing

    第8楼2012/11/06

    回七楼:
    关于性能,我们做过一些相关的案例,还是不错的,可以说70%的氨基柱案例都可以用这个柱子来替代;60%的硅胶柱案例,用hilic分离可以完全取代;上样量和回收率都不错;也没有像硅胶那样大的死吸附,所以寿命就很好。这个案例只做了20多针,项目就结束了。别的项目,我们专门考察过的,100多针没问题。至于价格,会贵点,但是如果稳定性好,综合价格就会低不少;就看比的标准是什么了。

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  • gaoshan_lanjing

    第9楼2012/11/21

    嗯。性价比很重要,耐用,还得便宜,呵呵。

    houjjun(houjjun) 发表:一般的客户都关心性能、价格和寿命

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  • houjjun

    第10楼2012/11/21

    还得好用

    gaoshan_lanjing(gaoshan_lanjing) 发表:嗯。性价比很重要,耐用,还得便宜,呵呵。

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