生物工艺学(下)教案

第一章 预处理及固液分离
第一节 发酵液（培养液）的预处理
预处理的目的

? 改变发酵液（培养液）的物理性质，以利于固液分离。主要方法有：加热、凝聚与絮凝、使用助滤剂。

? 去除发酵液（培养液）中部分杂质以利于后续各步操作。
预处理的方法
一、加热
加热是最简单和经济的预处理方法，即把发酵液（培养液）加热到所需温度并保温适当时间。加热能使杂蛋白变性凝固，从而降低发酵液（培养液）的粘度，使固液分离变得容易。但加热的方法只适合对热稳定的生物活性物质。
预处理的方法
二、凝聚和絮凝
凝聚和絮凝在预处理中，常用于细小菌体或细胞（分泌胞外产物）、细胞的（分泌胞内产物）碎片以及蛋白质等胶体粒子的去除。其处理过程就是将一定的化学药剂预先投加到发酵液（或培养液），改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。但是应当注意，凝聚和絮凝是两种方法，两个概念，其具体处理过程也是有差别的。
1．凝聚
凝聚是指在某些电解质作用下，破坏细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使胶体粒子聚集的过程。
凝聚剂主要是一些无机类电解质，由于大部分被处理的物质带负电荷（如细胞或菌体一般带负电荷），因此工业上常用的凝聚剂大多为阳离子型，分为无机盐类、金属氧化物类。常用的无机盐类凝聚剂有：Al2（SO4）3?18H2O（明矾）、AlCl3?6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等；常用的金属氧化物类凝聚剂有：Al(OH)3、Fe3O4、Ca(OH)2或石灰等。

2．絮凝
絮凝是指使用絮凝剂（通常是天然或合成的大分子量聚电解质），在悬浮粒子之间产生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程。
常用的絮凝剂有聚丙烯酰胺、聚氧化乙烯、、聚丙烯酸钠和聚苯乙烯磺酸。
影响絮凝效果的因素很多，主要是絮凝剂的分子量，絮凝剂用量，溶液pH，搅拌速度和时间等。

三、使用惰性助滤剂
工业生产中有时需加入某些固体物质，以加速过滤速度，提高滤液质量，这种能提高过滤速度的物质称为助滤剂
助滤剂的使用方法有两种：①在过滤前先在过滤介质表面预涂（铺）一层助滤剂。②助滤剂按一定比例均匀加入待过滤的料液中。
常用的惰性助滤剂有硅藻土、珍珠岩、混合助滤剂（硅藻土或珍珠岩与石棉）、纤维素和活性炭。
助滤剂的选择要点如下：
（1）粒度选择
（2）根据过滤介质和过滤情况选择助滤剂的品种
（3）用量选择
四、去除杂蛋白质的其它方法
1．等电点沉淀
蛋白质在等电点时溶解度最小，能沉淀而除去。
2．变性沉淀
使蛋白质变性的方法有：加热、大幅度改变pH，加有机溶剂（丙酮、乙醇等）、加重金属离子如Ag＋ 、Cu2＋ 、Pb2＋等、加有机酸如三氯乙酸、水杨酸、苦味酸、鞣酸、过氯酸等及表面活性剂。
3．吸附
在发酵液中，加入一些反应剂，它们互相反应生成的沉淀物对蛋白质具吸附作用而使其凝固。
预处理的方法
五、不溶性多糖的去除
当发酵液中含有较多不溶性多糖时，粘度增大，液固分离困难，可用酶将它转化为单糖以提高过滤速度。例如在蛋白酶发酵液加α－淀粉酶，将培养基中多余的淀粉水解称单糖，就能降低发酵液粘度，提高滤速。
预处理的方法
六、高价金属离子的去除
对提取和成品质量影响较大的无机杂质主要是Ca2＋、Mg2＋、Fe3＋等高价金属离子，预处理中应将它们除去。
? 去除钙离子，常采用草酸钠或草酸。
? 镁离子的去除也可用草酸，但草酸镁溶解度较大，故沉淀不完全，也可采用磷酸盐，使生成磷酸钙盐和磷酸镁盐沉淀而除去。
? 除去铁离子，可采用黄血盐，形成普鲁士兰沉淀：
作业：
? 改变发酵液过滤特性的主要方法有哪些？其简要机理如何？
? 除去发酵液杂蛋白的常用方法有哪些？

第二节 细胞破碎
一、概念
破坏细胞壁和细胞膜，使胞内产物得到最大程度的释放。
二、影响细胞破碎的因素
1、细胞壁的结构
2、破碎方法
细胞壁的结构
? 细菌
　革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖层（约20－80nm）组成，而革兰氏阴性菌肽聚糖层较薄，仅2－3nm，在肽聚糖层外还有两层外壁层。外壁层约8－10nm，可见革兰氏阳性菌细胞壁较厚，较难破碎。 　　
? 霉菌
霉菌的细胞壁较厚，约100－250nm。
? 酵母菌
酵母的细胞壁比革兰氏阳性菌的细胞壁厚，更难破碎。
　　　　　　　　　　　　　　
破碎方法
? 机械法
高压匀浆法
高速珠磨法
超声波破碎法
? 非机械法
化学法
酶解法
物理法：渗透压冲击法、冻融法
干燥法
1、非机械法

A、高压匀浆法
适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉等。不适用于高度分枝的微生物。
B、高速珠磨法：利用玻璃小珠与细胞悬液一起快速搅拌，由于研磨作用，使细胞破碎。
C、超声波破碎法：实验室常用
影响因素：频率、液体温度和粘度、处理时间等。

2、非机械法
A、化学法：采用化学试剂处理细胞，溶解细胞或抽提细胞组分

B、酶解法
利用酶（溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、透明质酸酶等）反应分解破坏细胞壁上特殊的键，以达破壁的目的。需与其它方法配合使用（辐射、渗透压冲击、反复冻融法等）
? 途径：在细胞悬液中加酶或采用自溶作用
? 自溶作用：利用微生物自身产生的酶来溶菌，而不需外加其它的酶
? 自溶的方法：
加热法、干燥法
C、渗透压冲击法
先把细胞放在高渗溶液中，由于渗透压作用，细胞内水分向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化，胞外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂。
D、冻结-融化法
将细胞放在低温（-150C），然后在室温中融化，反复多次，细胞壁破裂。

E、干燥法
经干燥后的菌体，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。
方法：空气干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥

三、破碎率的评价
细胞破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即：
Y(%)=[(N0-N)/N0]×100
N0－原始细胞数量
N－经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量

目前N0和N主要通过下面的方法获得 ：
? 直接计数法
在血球计数板用显微镜观察，直接对适当稀释后的样品进行计数。
? 间接计数法
间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（例如可溶性蛋白、酶等）。通过做法是将破碎后的细胞悬浮液离心分离掉固体（完整细胞和碎片），然后用Lowry法测量上清中的蛋白质含量。
四、各种破碎方法的评述
? 高压均浆和珠磨两种机械破碎方法，处理量大，速度非常快，目前在工业生长上应用最广泛。但在机械法破碎过程中，容易产生大量的热量，使料液温度升高，而易造成生化物质的破坏，特别是在超声波处理时。因此，超声波振荡法主要适用于实验室或小规模的细胞破碎。

? 非机械法一般仅适用于小规模应用。渗透压冲击和冻结－融解法都属于较温和的方法，但破碎作用较弱它们常与酶解法结合起来使用，提高破碎效果。干燥法属于较激烈的一种破碎方法，容易引起蛋白质或其它组分变性.

五、破碎方法的选择依据
?处理量
高压匀浆和珠磨机处理量大，速度快，适用于工业生产
?产物对破碎条件（温度、化学试剂、酶等）的敏感性以及产物在细胞中的位置
生化物质的稳定性
?细胞的数量和细胞壁的强度
?破碎程度
?提取分离的难易
总之，适宜的细胞破碎条件应该从高的产物释放率、低的能耗和便于后续提取这三方面进行权衡。

第三节 固液分离

? 固液分离：是指将发酵液（或培养液）中的悬浮固体，如细胞、菌体、细胞碎片以及蛋白质等的沉淀物或它们的絮凝体分离除去。
一、固液分离设备
? 过滤设备
板框压滤机
真空鼓式过滤机
? 离心设备
过滤式离心机
沉降式离心机

1、过滤设备
? 板框过滤机
原理
特点 板框压滤机的过滤面积大，能耐受较高压力差，对不同过滤特性的料液适应性强，同时还具有结构简单，造价较低，动力消耗少等优点。但这种设备不能连续操作，设备笨重，占地面积大，非生产的辅助时间长（包括解框、卸饼、洗滤布、重新压紧板框等）。
适用对象 广泛应用与培养基制备的过滤及霉菌、放线菌和酵母菌和细菌等多种发酵液的过滤 。

2、离心设备
? 过滤式离心机
转鼓上开有小孔，转鼓内表面覆盖过滤介质，在离心力的作用下，液体穿过过滤介质经小孔流出，固体被截留在过滤介质表面。主要用于处理悬浮液固体颗粒较大、固体含量高的场合。
? 沉降式离心机
转鼓上无小孔，不需要过滤介质，在离心力的作用下，固体沉降于鼓壁上，余下的即为澄清的液体。适用于固体量较低（小于10％）的场合。常用的沉降式离心机有碟式离心机和管式离心机。
二、过滤方式
? 常规过滤
料液流动方向与过滤介质（能使固液混合料液得以分离的某一介面）垂直。

? 错流过滤
料液流向平行于过滤介质。过滤介质通常为微孔膜或超滤膜。

三、影响固液分离的因素
? 微生物种类
真菌的菌体大，固液分离容易，可采用鼓式真空过滤或板框过滤；细菌和细胞碎片小，固液分离较难，固液分离前要采用一些手段增大粒子。
? 发酵液黏度
固液分离速度与黏度成反比
? 其它因素
发酵液的PH值、温度和加热时间
四、固液分离的发展动向
改善固液分离的手段主要从下列三方面进行：
? 利用错流过滤
? 利用遗传工程的方法来改变菌体的大小和形状
? 采用双水相萃取处理细胞匀浆液
作业：
1.简述常用细胞破碎方法的原理、特点及适用范围。
2.简述常用过滤设备的原理、特点及适用范围。
四、固液分离的发展动向
改善固液分离的手段主要从下列三方面进行：
? 利用错流过滤
? 利用遗传工程的方法来改变菌体的大小和形状
? 采用双水相萃取处理细胞匀浆液
作业：
1.简述常用细胞破碎方法的原理、特点及适用范围。
2.简述常用过滤设备的原理、特点及适用范围。

一般的生物制品都是这流程吗？

第十二章 固相析出技术
基本概念
固相析出技术：通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以固体形式（沉淀和晶体）从溶液中沉降析出的分离纯化技术称为固相析出技术。
结晶法：在固相析出过程中，析出物为晶体时称为结晶法。
沉淀法：在固相析出过程中，析出物为无定形固体时则称为沉淀法。常用的沉淀法主要有盐析法、有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法等。

第一节 盐析法
一、盐析法的原理及特点

盐析法的原理
1）中性盐离子中和蛋白质表面电荷。
2）中性盐离子破坏蛋白质表面水膜。

盐析法的特点
经济、安全、操作简便、不需特殊设备、应用范围广泛、不易引起蛋白质变性 ，但盐析法分辨率不高，适合于生化物质粗提纯阶段，需和其它方法交替使用。
二、盐析常用的盐
常用的盐析用盐主要有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠、磷酸钾等。
硫酸铵具有盐析作用强，溶解度大且受温度影响小，一般不会使蛋白质变性，价廉易得，分段分离效果较好等优点，所以大多数情况下都采用硫酸铵进行盐析。但硫酸铵具腐蚀性且缓冲能力差，饱和溶液的pH值在4.5～5.5之间，使用时多用浓氨水调整到pH7左右。

三、影响盐析的因素

盐饱和度的影响

不同的蛋白质，其结构和性质不同，盐析时所需的饱和 度也就不蛋白质浓度的影响 在相同的盐析条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀，但蛋白质的浓度愈高，其它蛋白质的共沉作用也愈强，从而使分辨率降低，一般常将蛋白质浓度控制在2～3％为宜。

PH的影响 进行盐析时的pH，要选择在被盐析的蛋白质的pI附近。

温度的影响 在高盐浓度下，它们的溶解度随温度的升高反而降低。另外，高温还易导致蛋白质变性。蛋白质的盐析一般在室温下进行。

四、盐析操作（以硫酸铵为例）
盐析时，将盐加入到溶液中有两种方式：
（1）加硫酸铵的饱和溶液。
为达到一定的饱和度，所需加入的饱和硫酸铵溶液的体积可由下式求得
S2 － S1
V= V0
1 － S2
式中V－加入的饱和硫酸铵溶液的体积，L；
V0—溶液的原始体积，L；
S1及S2—初始和最终溶液的饱和度，％。

四、盐析操作（以硫酸铵为例）
（2）直接加固体硫酸铵。
为达到所需的饱和度，应加入固体硫酸铵的量，可由表查得，或由下式计算而得

X=

式中 S1及S2—初始和最终溶液的饱和度，％；
X—1L溶液所需加入得固体硫酸铵的克数；
G—经验常数，0℃时为515；20℃为513；
A—常数，0℃时为0.27；20℃为0.29。

第二节 有机溶剂沉淀法


一、有机溶剂沉淀法的原理和特点
原理
1）加入有机溶剂后，会使水溶液的介电常数降低。

2）破坏蛋白质表面的水膜。
特点 分辨率高于盐析；乙醇等有机溶剂沸点低，易挥发除去，不会残留于成品中，产品更纯净；沉淀物与母液间的密度差较大，分离容易。但有机溶剂沉淀法易使蛋白质等生物大分子变性，操作需在低温下进行；需要耗用大量有机溶剂，成本较高，有机溶剂一般易燃易爆，所以贮存比较困难或麻烦。

二、常用的有机溶剂

常用于生物大分子沉淀的有机溶剂有乙醇、丙酮和甲醇等。其中乙醇是最常用的沉淀剂，因为它具有沉淀作用强、沸点适中、无毒等优点。
三、有机溶剂的用量计算
进行有机溶剂沉淀时，欲使原溶液达到一定的溶剂浓度，需加入有机溶剂的量可参考表或按下面的公式计算：
S2 － S1
V= V0
1 － S2
式中，V—需加入的有机溶剂的体积；
V0—原溶液体积；
S1—原溶液中有机溶剂的浓度；
S2—需达到的有机溶剂的浓度；

四、有机溶剂沉淀法的影响因素
温度
有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显著升高，从而增加有机溶剂对蛋白质的变性作用。另外，温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。因此，在使用有机溶剂沉淀生物高分子时，整个操作过程应在低温下进行。
pH值
pH多控制在待沉蛋白质的等电点附近。
样品浓度
样品较稀时，将增加有机溶剂投入量和损耗；样品太浓会增加共沉作用。一般认为蛋白质的初浓度以0.5～2％为好，粘多糖则以1～2％较合适。
l 中性盐浓度
较低浓度的中性盐存在有利于沉淀作用，减少蛋白质变性。一般在有机溶剂沉淀时中性盐浓度以0.01～0.05mol/L为好，常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等。

四、有机溶剂沉淀法的影响因素
l 某些金属离子
一些金属离子如Ca2+、Zn2+等可与某些成阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶剂用量。
作业：
1.盐析法为何能用于分离蛋白质混合物？盐析法一般用于生物分离的哪个阶段？
2.有一20mL的料液，要采用直接加固体硫酸铵的方式进行盐析，其硫酸铵饱和度为20％，需要达到的硫酸铵饱和度为40％，问需加入多少固体硫酸铵？操作时应注意哪些问题？
3．有机溶剂沉淀法在操作时应注意哪些事项？
4．某一30mL料液中乙醇浓度为35％，要将乙醇浓度调整到55％，需往料液中加入多少mL的无水乙醇？