微生物工作者讲述自己的故事

题目：质粒构建之酶切位点的选择

结论：一定要选择具有相同buffer的两个酶

技术背景：
克隆目的基因，并把其装入表达载体转化/转染原核细胞/真核细胞中，是获取目的蛋白/研究基因功能的经典方法，也是目前科研工作者常用的方法。其中酶切是该技术不可缺少的一部分，随着载体设计技术的发展，双酶切以其独特的优点而逐渐取代了单酶切 。
具体实验流程如下：
设计合成含有酶切位点，能扩增基因ORF全长的一对引物——PCR扩增目的基因——纯化PCR产物——分别对PCR产物及载体进行双酶切——分别纯化双酶切产物——连接目的基因与载体——转化大肠杆菌——筛选阳性克隆——质粒提取——转化/转染——获得重组蛋白/功能研究
酶切反应虽然是在PCR之后，但是酶的选择却是在PCR前引物设计时就完成了。我觉得这就是错误的根源！

故事：导师给我的第一个课题就是研究病毒包膜蛋白的功能，首先我需要克隆出该基因，并把它装入真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建重组质粒。根据pcDNA3.1(+)载体多克隆位点的内切酶排列顺序，在设计引物时，我在上下游引物的5'端分别引入两个常用的便宜得内切酶：BamHI/XhoI。引物送公司合成后，就开始实验：PCR过程非常顺利，一下就把目的基因拉出来了。但是怎么也想不到，这个载体我忙了半年也没有构建成功。由于PCR后面的酶切，连接，转化试验都无法进行成功性的鉴定，试验只有拿单克隆细菌进行鉴定。可是我的平板上始终看不到有单克隆生长。所以错误可能出现在PCR后的任何一个环节。
下一步就是要找出错误发生在哪里！最容易的鉴定就是感受态细胞了，拿载体做了一个阳性对照，结果板上密布菌落。这说明感受态细胞以及转化的过程没有问题。
那问题很有可能出在两个地方：1.双酶切没有完全切开 2.连接没有成功！由于师兄用同样的两个酶有成功的先例，所以我主观判断是连接出了问题！判断的失误导致我浪费半年的时间：购买新的T4连接酶，不停的摸索连接条件，不停的更换目的基因与载体的比例，应用平端连接的连接体系.......半年时间就在痛苦的重复和思索中过去了。老板不得已给我更换了课题！后来实验室又要构建重组质粒，由于我“经验丰富”，老板把这个重任又交给了我。这次在设计引物时，无意中我更换了酶切位点（目的序列中含有XhoI的序列，不可用），选用HindIII/BamHI。实验结果出奇的顺利，两个星期内我就把测序鉴定正确的质粒大提后交给老板！
我反思：为什么我做了半年没做出来，而这次半月就搞定了呢，极有可能使酶切的问题：BamHI/XhoI没有共同的buffer，不管加入哪一种buffer，都有一种酶的活性只有50~70%，而HindIII/BamHI却有着共同的buffer，在双酶切体系中两个酶的活性都达到100%。
为了证明这一设想，我又重新设计引物，选用HindIII/BamHI这两个酶，结果被我一举拿下这个重组质粒！
之后，老板把实验室所有重组质粒的构建任务都交给了我，两年内我成功构建了8个重组质粒。

做实验要学会与别人交流，转换思维，记住这句名言：条条大路通罗马

我以前构建过一个质粒，难点就在于片断两端都是EcoRI位点，片断长度2.8Kb，也算是大片断连接了。我是这样做的，载体分步酶切，然后碱性磷酸酶去磷酸化，然后就于片断进行连接反应，结果做了两个月都没做出来，每天都是重复性的工作，有一天老板问起了情况，说连接反应时不一定要使用连接酶说明书上介绍的方法，交了我一种连接方法，步骤如下：

载体 0.5微升
片断 5微升 （载体：片断 1：10 片断量要高些）
Ligase buffer 5微升
T4DNA ligase 1微升
ddH2O 38.5微升
总反应体积50微升。

把反应夜放在冰上，将冰块连带反应夜室温下放过夜，第二天,用酚氯仿抽提，然后用2倍体积乙醇和1/10体积的3M NaAc沉淀，沉淀用70乙醇洗涤，自然条件下风干，沉淀用10微升TE溶解，取5微升进行转化。

结果一下就作出来了阳性克隆。

所以，我想说的是，大家要多与人交流，标准的做法不见得是最好的方法，当一条路行不通时，你可能会发现另一条光明大道。

有分加，我也来凑个热闹！
我是做细菌方面的，最近在实验室忙了半个月，来谈谈吧
感想一：做实验不能急，一定要耐心，有的时候急着去吃饭（怕晚了饭堂没吃的了）匆匆的做实验，效果极其不好，反而要重做，所谓宁停一分不抢一秒，很有道理。做不好重做的话不仅是浪费东西又耗时间还影响心情。
感想二：练好基本工（做细菌的就是划平板、染色等操作）。练好基本工能达到事半功倍的效果。本人曾经划板的水平相当的差，分个单菌落都花了好长一段时间。基本工练到一定程度就会悟出些技巧，比如挑菌划平板的时候，要掌握好度不然分出的单菌落会比较少，长出很多大菌落。染色的过程脱色是关键。
感想三：要有反复实验的心理准备。有的时候，除了主观操作的原因还会有些客观的原因，比如我试过养标准株（冻干奶粉保存的），开始养不出来，后来发现是标准株的浓度太低要挑多一些的干粉才能养出。所以要大胆的构想，小心求证。
感想四：要做好记录，理好思路，每天从实验室回来的时候要想好明天要做什么，最好些在笔记本上。尤其是配液配平板这些要早些准备好，不然到用的时候就没得用，很不方便。
感想四：我发现染色看似简单，其实中间还很多的问题。有的时候阳性染成阴性，阴性染成阳性（以前有个帖子有讨论过这个问题的），的确是这样子的。我 个人的总结是：1菌不能太老才来染色，菌活性降低会有些形态染色上的变化。2、我做革兰氏染色时发现，染完每一液后一定要把冲洗液甩干净，不然加下一液的时候就会把染液稀释掉，结果就不一定与事实相一致。比如，酒精被稀释后会导致脱色不全，阴性变阳性。

另外我还发现，买来的标准株不一定是纯的，我就遇到过这个问题，我要的是阴性杆菌但里面混了很多阳性球菌。我实验室其他的同学也遇到过这种问题

就这么多，以后再有其他感想再说

我是做微生物发酵方面的。我也说个小故事。

一次偷懒，晚上做好的纤维素水解液没有及时处理（因为考虑到酸性很强pH 值小于1.0）。第二天早上也没有记起，等到晚上想用时一看，里面的液体都变混浊了，当时本想一扔了事，旁边一师弟却很惊奇的拿过去说，什么菌能在这种条件下生长啊？一句话提醒了我，于是采取划线分离，挑单菌落。除了有霉菌，居然还发现一株和我当时用的菌的形态很相识的（酵母菌，有颜色）。后来经过鉴定这株菌就是我一直用的那株菌，经过这件事，事后又有目的的在水解液中反复驯化了这株菌，最终得到了用于后来实验的菌。

得出结论：实验中一定要细心，偶尔偷懒也不一定是坏事噢：）

我对微生物方面的东西知道的很少，我是做那种纯粹的分子生物学试验的人，因为研究生读书的研究所是中国最早的专业分子生物学研究所之一，前面我说过，我做试验很少失败（到现在真还没有什么失败的记忆）。当然，读书的时候有不懂的可以问，我们研究所一般的试验基本都有相当基础，后来工作后，也说过了，一切得自己操办。废话这多，得出做试验的一些教条主义为：
其一.对自己不熟悉的试验，在进行之前一定要把握方方面面的资料（包括看相关文献）和情况，可以在试验正式开始之前几天先想好有哪些试剂需要提前准备的（如是试剂盒则需要提前达一周，一月准备定购），当你“觉得”万事具备的时候，你可以在头脑中把整个试验过程想象着做一遍。这样你会发现其实还有很多细节问题没解决。我经常在回家的路上或洗澡、如厕和临睡前想试验和写标书的问题，效果奇佳，可以把所有的细节疏忽都想到。
其二.在开始做试验时刻起，你就应当养成一个好的试验习惯，尤其是无菌观念和操作必须非常强，不是说所有的试验都要求无菌，而是一旦真正需要无菌的时候，往往哪些无菌操作不熟练的人就会犯糊涂了。举个例子，÷偶曾有一博士师兄，做事慢慢腾腾，似乎稳稳妥妥，但是养细胞则经常污染，为何？因为他对究竟在哪个环节可能导致污染缺乏认识，所以把注意力分散在一些次要环节，而对真正的核心环节做得不到位。对RNA相关试验的操作对无菌观念也是一个挑战，如果你能做好大型RNA试验表明你无菌操作基本过关了。开启EP管的习惯和放枪的习惯都可以影响到你的无菌操作，疏忽不得。
其三.我说的这一点基本上少有人认识到，那就是做微观试验的宏观认识。分子生物学试验是微观而又微观的东西，任何一个结果必借助放大或媒介方能看到结果和效果，但是，我要提出的是，其实分子生物学试验是个极其宏观宏量的玩意，为什么这样说呢？我说的宏观是试验对象的量的宏观，抽提DNA时候的DNA分子，PCR试验中的扩增产物，蛋白质表达的分子数量，基因克隆中的载体和目的片断数量及随后的克隆菌落数量，太多了，我就不一一指出了，有心的看客可以自己思量，如果你对这些宏观的东西有了一定认识之后，你会发现很多分子生物学试验说来精细，其实粗糙的不行，而知道了这种粗糙你就知道虽然操作小有变化，试剂小有不同，方法小有创新，手法小有不同，污染小有存在，等等，其实结果可以大有一致，哈哈。也就是说只要你达到了一个range内，你的试验结果就是可以预期的了，不必紧张兮兮，我就是发现了这个才做试验无往不利的。举个例子，很多PCR小菜鸟把PCR看的神神秘秘，我在菜市场操作都可以出结果，呵呵。
其四.因为有了三，所以必然会出现四。我在理解三的基础上，对做试验基本都要进行一番“创新”，可以说，打从做试验的第一天，我就少有规规矩矩、本本分纷做试验的，所有的试验，如果我觉得有不妥，不够完善的地方我都按照自己的想法去做，去改进。比如早在2001年我就在我们实验室第一个自创菌落直接PCR，当然，或许别的实验室已有先例，但我是自己想到的。现在还有很多细菌文献里面的老外津津有味地写怎么怎么抽提DNA再做PCR，简直搞笑（金黄色葡萄球菌等个别革兰氏阳性菌例外哦）。做转化试验也不是按照操作说明做的，直接多涂布一些，菌落也做收集，摇床里面摇的时间则又缩短一些等等。『后补的一句：负责地告诉你，做这一点前您老必须掌握一定的分子生物学基本理论，理论是实践基础，切记切记！』
其五.当试验进展不顺的时候，千万不要盲目死做，必须停下来，回头反复看相关文献，看别人的方法，可以搜索或来DXY等论坛看看，有条件可以和别人讨论讨论，当然，这种事情我没什么经验，我的经验在试验之前就做了，这是为别人解决问题的时候用的最后一招。我身边有初学分子生物学试验的人，我会帮他解决一些试验中遇到的问题，那么怎么解决试验中的问题呢？我是这样想的，把问题基本从中间分成两部分，考虑可能从前半还是后半出问题。
我举三个例子。
第一个例子，我们实验室刚开张的时候我做PCR，结果没有任何结果。这个问题很麻烦啊，因为刚开张，任何一个环节试剂均有可能出问题，没有一项是确定没有问题的。那么你可以考虑是PCR本身出了问题还是电泳出了问题，电泳是否出了问题可以看Marker有无得出结论，结果Marker有条带，说明是PCR的问题，PCR的问题可能出在反应条件上、PCR仪上、模板的制备上或PCR体系上，反应条件回顾参考资料啦，确保没有弄错，参考文献权威；PCR的问题我暂时没办法解决；模板的制备可以再试试其它几种模板或浓度；然后在考虑反应体系上，哪些试剂浓度可能有问题，一般酶和缓冲液出问题可能性小，PCR七种玩意，最后只剩下dNTP，后来发现我把它的dNTPs浓度看成了单一一种的浓度，翻了四倍，导致试验失利。
第二个例子，同事做AFLP没结果，用的是试剂盒，也可把问题分成两段，前者试剂盒操作部分，AFLP的扩增；后者电泳。这个问题有点类似PCR问题，AFLP没结果，电泳有无问题先看Marker，当然，他这个试验两个问题都有，我先解决电泳问题呀，电泳可先只跑Marker直到出结果，我们限于条件只能用银染法，电泳本身出问题可能性小，多半是染色、脱色或显色哪个环节出了问题，一一试之啦，改变条件。解决了这个电泳的问题之后解决AFLP的问题，如果你对这个试验了解的话，应该知道它包括提取基因组DNA、酶切、接头连接和第一轮扩增和第二轮扩增（选择性扩增），DNA及其质量有无问题，酶切有无问题均可通过电泳看到，两轮扩增的话，我就让他直接跑个琼脂糖凝胶电泳，第一轮看不到，第二轮理论上是看得到的。
第三个问题，还是我这位同事啦，提取DNA的时候，预试验满好，大规模一提就没东西了，着急呀，怎么越来越退步了，呵呵。提取DNA如果有问题的话有哪几个步骤是关键的呢？细菌的菌量，选用的方案，细菌破壁是否充分，酚氯仿抽提有无问题这几个问题是最关键的，其它都属于小问题。酚氯仿有无问题看电泳，如果电泳什么都没有，更上游一定有问题，如果电泳点样孔有亮带，表明酚氯仿抽提有问题，蛋白质没抽提干净；选用的方案你就得重新看看程序本身有没有问题了，这个也不难解决；菌量和破壁两个问题因果相关，量大了破壁肯定不充分，量小的话破壁如果试剂没加错或浓度不过低应该没有问题，OK，就大量减少菌量来抽提，结果发现确实是菌量的问题。

题目：关注培养基质量，提高实验成功率。
结论：目前商品化的培养基第一次试验需要自己全面检测一下。
技术背景：使用浊度法测量抗生素效价，需要纯度、灵敏度均很高，代数少的细菌。
故事：有一段时间做比浊法效价测量，发现试验结果莫名奇妙的变差。主要表现为，细菌生长不均一，同浓度菌液培养所得吸光度相差很大。通过分析，能排除由于加样量差异、培养温度差异、所用培养皿差异等因素造成的影响。最终怀疑新更换的培养基有问题，结果测量灭菌后pH值比标示的低0.5左右，用NaOH调节pH值后，试验结果正常。
总结：目前由于培养基引起的细菌生长异常常常被忽视，经常做细菌培养的战友应该在新更换培养基的时候全面检测一下。

题目：不要盲从所谓的大牛。
故事：几年前我在从事益生菌研发，主要负责实验室工作。我们分离得到了几株乳酸菌，其生长特性及对致病菌的抑制效果等各方面的特性均表现不错，我们选了一株进行发酵条件的优化，并进行了小试研究，研制了一种益生素配方，并在养殖场进行了饲喂效果试验，反映较好。所以，老板将该菌及相关配方拿到某家国内知名的发酵企业做中试和生产。由老板和某发酵专家制定发酵方案，呵呵，怪事出现了，该菌在中试罐里就不生长了，没有生长的迹象，反反复复都是如此。后来，老板没有办法，就叫我过去看看，我到厂里，他们正在进行新的一批发酵，已经接种8小时了，OD一点变化的没有，他们正在商量是否倒罐。我说你们先别着急，等我看一下再说吧，我花了半小时，看了他们的配方和工艺以及管道走向等，说了一句，“把进气口关上”，负责人说，“不行啊，会污染的。”我很有信心的说，“不会的，放心吧，这株菌不会被污染。“结果关上进气口，2小时后，OD明显升高，通过pH测定和镜检观察，确定没有被污染，从此中试和发酵生产顺利进行。原来，该企业一直做的都是好氧菌，通行做法是5吨罐需要保持5公斤的罐压，防止污染。大家知道，乳酸菌是兼性厌氧的，通气保压自然会导致乳酸菌生长受到抑制。
结论：1.思维会有定势，专家也会犯错。
2.我们常常说在学校没有学到东西，或者学的东西没有用；其实是我们没有学到家，没有学活，不会应用。

我从事微生物发酵工作5年，后又进行分子生物学实验将近三年，在此期间我做过
几个大的项目，也亲自下过车间，建设过车间、实验室、中试等等，可以说感想很多，
也想唠叨几句，各位见笑了！
1、首先我们应该不要去管别人怎么样，关键的还是首先要管好自己。就象以上战友讨论的一样
有一个良好的习惯和作风，老板导师不好，就是自己努力也照样能成才，虽然有时是苦了些，但是
我们靠自己走出来的路都会留下我们自己的足迹，也就是我们能够学习到很多的经验教训，其实
大家也很明白，靠一两年的时间做出很大的成绩是很难的，所以我们关键是要学习技术，提高自己
各方面的技能。
2、抓住任何机会，发牢骚是没有用的，不如用这点时间去学习。这样说简单，能做到的人可是很少，
但是能做到这点的肯定是不一般的人。
3、作实验首先要有良好的习惯，我们每个步骤都要仔细认真，我曾经由于不仔细配错了一点药品，导致
我三个月没有做出一点东西。做的慢没有关系，关键我们要一步一个脚印的做，这样反而会更加节省时间。
部分战友已经感知到了！
4、认真观察，认真分析，经常要和相关人士进行探讨学习！我们进行实验时就是和国外教授经常联系，
他们都很认真的回答我们提出的问题，我们每次也都很认真的告诉他们我们实验的进展情况。提供各经验
和老外打交道需要认真负责，每次发邮件时要把细节写的清楚，同时很真诚的道谢，一般都会有所收获的。
5、在什么地方就要适应什么样的环境，既然我们不能改变它那我们就去适应它，在适应的同时我们也会
有很大的收获。我经历了五六岗位，换了几次工作，每次开始都会不适应，但是自己踏心下来把工作和实验
搞的很好，然后我就又有了更多的机会。
6、兴趣是做好一件事情很关键的要素，所以我们尽量去选择自己感兴趣的东西，如果有选择机会的话。
坚持说来简单，真正能坚持到底的绝对是英雄。应为我有很多次都没有坚持下来，有毅力和横心坚持完成
一件任务的人绝对值得佩服。
7、时间不等人，要抓紧机会，一步错拉下，那么可能会一辈子被拉下！

我是搞海洋微生物活性代谢产物方面的。我做论文期间，曾花费1年多时间从事这很无聊的工作：从海洋样品中分离出海洋微生物。起初做这项工作感到很茫然，由于老板是搞分子生物学的，现在想插足天然产物方面。我本人的专业是发酵工程的，与天然产物也相距甚远，基本上属于两头抓瞎。由于我与实验室的研究方面不一样，也得不到师兄师姐指导，并且天然产物方面，实验室能够完成简单的分离纯化，但测定结构要上别的地方，这一阵子简直都要把我郁闷死了。只好埋头搞我的微生物，包括分离菌种、测定活性、比较各菌株所产的成分之间的差异（我把它称之为化学筛选，其实就是做做TLC)。当初是不得已而为之，现在想来，也并非白干了。前期工作做得比较扎实，我选出了几株自认为比较好的菌株——其实谁也不能确定能不能从中发现新化合物，我认为较好，无非就是活性较好，或者TLC图谱比较有特点——希望能够从中发现新结构化合物。这一阵子真是过的浑浑噩噩。
后来得到一个好机会，老板与德国人合作，派我去德国分离鉴定化合物。时间顶多只有8个月（去了才知道，德国老板实际上就给6个月的津贴，额外的2个月是中国老板要求的，只好把钱匀着花）。真是上天不辜负我前期一年多的辛苦工作，去了之后过了一阵子就发现了7个新结构。
当然不可否认，天然产物研究，运气很重要。但我认为，我之所以能在短时间内就发现新结构，与我带去的菌株有很大关系，我研究了3株菌，有2株都有新结构。要不是老板非要我研究他让我带的菌，我想我还有机会多研究几株我的菌，实际上从他的菌中，我一无所获。
我认为，如果你像我一样没有什么经验，那么最重要的是进行化学筛选，其实很简单，当你将数百株微生物的一一培养，提取粗提物，然后将他们点在TLC板上展开，比较斑点的差异，就总能发现一些菌株较为特别。这时候，统计规律在帮你挑选好的菌株，你所要做的只是扩大样本容量。
以上随想随写，有点零乱。但我的结局很惨，由于新结构是在德国发现的，发文章时德国人坚持他们第一单位，国内也没人撑腰，以至于现在我虽然文章的档次与数量都足够了，但却连拿学位的资格都没有。
靠，什么世道？