Chromatin Immunoprecipitation（ChIP）实验指南及技术总结

省部重点实验室

2013/09/24

私聊

生命科学仪器综合讨论

ChIP是一项比较流行的研究转录因子（ transcription factor, TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。

一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA片断——PCR分析。

在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量－PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q－PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。

我ChIP做的比较多，RIP和ChIP-chip也做过（ChIP-chip用的是罗氏Nimblegen的产品）。这边主要和大家交流一下做ChIP实验的心得。当然这个帖子肯定会有很多漏洞，但是希望能一起讨论一下。另外如果有同学对RIP或者ChIP-chip有兴趣，可以在回帖中指出来，我尽量及时回答。

PS：我的实验步骤基本参考upstate试剂盒的说明书。

一、ChIP实验步骤

第一天：
（一）细胞的甲醛交联与超声破碎。

1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9 ml）

2. 37摄氏度孵育10min。

3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。 450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。

4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。预冷后2000 rpm 5 min收集细胞。

6. 倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200 ul含2×10⁶个细胞。这样每100 ul溶液含1×10⁶个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×10⁶个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×10⁶个细胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800 ul。

7. 超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。

（二）除杂及抗体哺育。

8. 超声破碎结束后，10，000 g 4度离心10 min。去除不溶物质。留取300 ul做实验，其余保存于－80度。300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl （NaCl终浓度为0.2 M），65度处理3 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。

9. 在100 ul的超声破碎产物中，加入900 ul ChIP Dilution Buffer和20 ul的50×PIC。再各加入60 ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转混匀1h。

10. 1 h后，在4度静置10min沉淀，700 rpm离心1min。

11. 取上清。各留取20 ul做为input。一管中加入1 ul 抗体，另一管中则不加抗体。4度颠转过夜。

（三）检验超声破碎的效果。

取100 ul超声破碎后产物，加入4 ul 5 M NaCl，65度处理2 h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

第二天：

（一）免疫复合物的沉淀及清洗。

12. 孵育过夜后，每管中加入60 ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。

4度颠转2 h。

13. 4度静置10min后，700 rpm离心1min。除去上清。

14. 依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700 rpm离心1min，除去上清。

洗涤溶液：
a. low salt wash buffer----one wash

b. high salt wash buffer-----one wash

c. LiCl wash buffer------one wash

d. TE buffer------two wash

15. 清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100 ul 10％SDS， 100 ul 1 M NaHCO3， 800 ul ddH₂O，共1 ml。

每管加入250 ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500 ul。

16. 解交联：每管中加入20 ul 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M）。混匀，65度解交联过夜。

第三天：

（一）DNA样品的回收

17. 解交联结束后，每管加入1 ul RNaseA（MBI），37度孵育1 h。

18. 每管加入10 ul 0.5M EDTA， 20 ul 1M Tris.HCl（PH 6.5），2 ul 10 mg/ml 蛋白酶K。 45度处理2 h。

19. DNA片段的回收―――omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100 ul ddH₂O。

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第1楼2013/09/24

（二）PCR分析

二、技术总结

（一）关于细胞

细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。一般细胞长到75％－80％比较好。

（二）关于抗体

抗体是实验成败的致命因素之一！必须是IP级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和santa cruz的抗体，即使是IP级别的。单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强，背景低。但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），选择多抗比较稳妥一些。

（三）关于交联与超声破碎

这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。交联不充分，只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合，富集得到的Promoter的量不高，实验假阴性。交联过充分，基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。

一般来讲，按照我的经验，交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系，交联的条件也不一样。例如：NIH－3T3的交联条件是室温（25摄氏度）下15min，1％的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。当然如果你有bioruptor这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。一般，理想的超声破碎得到的片段大小是200 bp－1000 bp。但是200 bp－2000 bp的范围也是可以接受的。

（四）关于操作

希望尽可能的保持低温（4度）。沉淀的时候可以先在4度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速（500 rpm等）离心使其完全沉降。虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方，我还是希望你能够连续把它做完，直到PCR结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。

（五）关于解交联

虽然说明书上说4小时已经足够，但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里，DNA不会降解，过夜解交联更充分些。只是不要忘记在EP管口封上封口膜。

（六）关于DNA片段的回收

需要注意的是：样品中SDS样品较高，普通的PCR产物回收试剂盒回收，很有可能会在最终的样品中混入SDS，影响PCR实验结果。

小Tip：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除SDS沉淀。另外还有一些，一时想不起来。以后慢慢补充吧。