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有机沉淀法总蛋白提取实用小教程
省部重点实验室
2013/10/13
私聊
生命科学仪器综合讨论
从 植物 叶片提取的植物总蛋白不但是家养类动物生长发育的重要营养物质,而且是具有潜力的新一代营养保健食品,因而掌握植物叶蛋白的提取方法至关重要,让我们一起了解这整个实验原理和过程吧。
一、实验目的
熟悉植物叶蛋白的几种提取原理和方法,了解其意义及其应用价值。
二、实验原理
植物叶蛋白或称绿色蛋白浓缩物(leaf protein concentration,简称LPC),是从新鲜植物叶片中提取的高质量浓缩蛋白质,不仅是畜禽生长发育和生产畜产品的主要营养物质,而且目前也正成为人类的保健营养理想食品之一。天然蛋白存在于为数甚多的植物体内,对其分离应依据人们的利用目的及提取蛋白含量和品质加以考虑。
天然蛋白质一般在溶液中呈稳定的亲水胶体状态,故LPC 亦称叶蛋白胶。其特点是:
(1)水化作用 即蛋白质分子表面附有能有效防止蛋白质分子沉淀析出的水化膜;
(2)电荷排斥作用 水化膜外还有电荷层(具阴、阳离子)能有效地防止蛋白质分子的凝集。故溶液蛋白质颗粒(溶质)呈溶解状态;
(3)欲提取植物组织中的蛋白质必须利用溶解度的差异进行分离纯化(如盐析、有机溶剂分级沉淀法、疏水层析、结晶、加热、离心分离等法),利用分子大小和形状差异进行分离纯化(分子筛层析法);还可利用电荷性质的差异分离纯化(离子交换法)。只要创造上述影响因素,即可使蛋白质从植物叶片中分离并沉淀出来。
植物叶蛋白提取一般遵循如下基本原则:尽可能提高样品蛋白的溶解度,抽提最大量的总蛋白,减少蛋白质的损失;减少对蛋白质的人为修饰;破坏蛋白与其他生物大分子的相互作用,并使蛋白质处于完全变性状态。根据该原则,植物叶蛋白制备过程中一般需要有四种试剂
①离液剂:尿素和硫脲等;
②表面活性剂:又称去垢剂,早期常用NP-40、Tritonx-100等非离子型去垢剂,离子型去垢剂有SDS、胆酸钠、LiDS 等,还有象CHAPS(含它的蛋白溶液可以冻存)与Zwittergent 等双性离子去垢剂;
③还原剂:DTT、DTE、TBP、Tris-base 等;
④蛋白酶抑制剂及核酸酶:EDTA、PMSF、蛋白酶抑制剂混合物(Protease inhibitor cocktails)等,如为了去除缓冲液中存在的痕量重金属离子,可在其中加入0.1~5 mmol/LEDTA,同时使金属蛋白酶失活。
三、仪器和试剂
仪器
离心机、
移液器
、研钵、离心管、冰箱。
试剂
1. 20 mL 样品提取缓冲液:2.5 mL 0.5 mol/LTris-HCl
3. -20 ℃下预冷丙酮(含0.07% β-巯基乙醇)
4. -20 ℃预冷的80%丙酮(含0.07% β-巯基乙醇)
5. 饱和硫酸铵溶液 称取(NH
4
)
2
SO
4
80 g,加蒸馏水100 mL,加热50~60 ℃,搅拌溶解,室温过夜,用浓氨水调pH 至7.0
6. 0.05 molpH7.0的磷酸缓冲液10%NaCl 0.1mol 醋酸95%乙醇
7. 植物叶片(草本植物、木本植物叶片等都可)
四、实验步骤
植物叶蛋白的提取主要有盐析法、有机溶剂沉淀法、加热法(含逐步和快速加热)、 离心分离法、结晶和重结晶法等。依据今后的开发方向(以饲料为基础,以食品、饮品为开发方向)及简便易行和使用的原则,主要采用盐析法、加热法和有机溶剂法分离提取叶蛋白(冷提和热提)。不同的提取方法,对样品的处理方式、程度和要求不同,结果也有差异。
1. (NH
4
)
2
SO
4
沉淀法提取叶蛋白
取0.3 g 植物叶蛋白,用液氮充分研磨转入离心管中,加入3 mL 提取缓冲液,摇匀并放在4 ℃条件下提取1 h,充分溶解蛋白后,4 ℃10000 r/min 离心20 min,弃沉淀,上清液中加入(NH
4
)
2
SO
4
,混匀1 h,按1:2(v/v)加入-20 ℃预冷的80%丙酮,混匀后4 ℃12000 r/min 离心10 min,沉淀在-20 ℃冰箱中放置20 min,使丙酮完全挥发后加适量上样缓冲液,待沉淀充分溶解后,4 ℃12000 r/min 离心5 min,取上清液即为所提取的叶蛋白溶液。
2. 改良丙酮沉淀法提取叶蛋白
取0.3 g 左右的植物叶片,用液氮研磨,色素多的可按材料鲜重的10%加入PVP,并将充分研磨过的样品转入离心管中,加入4 mL 的提取缓冲液,摇匀并放在4 ℃条件下提取1 h,充分溶解蛋白。放置后的样品充分摇匀,4 ℃10000 r/min 离心30min,弃沉淀,上清液中加入2.5~3倍体积的村-20 ℃条件下过夜,让蛋白充分沉淀。之后,4 ℃10000 r/min 离心30min,其上清,沉淀置于-20 ℃下,使丙酮完全挥发,如有必要加入上样缓冲液溶解沉淀。缓冲液用量300 ul,沉淀充分溶解后,转移至1.5 mL 离心管中,4 ℃12000 r/min 离心15min ,取上清液即为所提取的叶蛋白溶液。
该方法提取的蛋白质,提取效率高,杂质干扰少,电泳结果蛋白条带清晰,数量多。
3. 植物叶片总蛋白的提取—三氯醋酸—丙酮沉淀法
①在液氮中研磨适量的叶片;
②悬浮于含10%的三氯醋酸和含0.07% β-巯基乙醇(可用DTT 代替)的丙酮溶液在-20 ℃条件下冰浴;
③让蛋白质沉淀过夜后离心(4 ℃ 10000 r/min 离心30~60min),弃上清;
④重悬沉淀浮于含0.07% β-巯基乙醇的预冷丙酮溶液中;
⑤离心(同上)后真空干燥沉淀;
⑥用上样缓冲液溶解沉淀,离心;
⑦Brandford 法定量蛋白,然后分装至Eppendof 管中保存在-78 ℃备用。
4. 分步提取可溶性叶蛋白
(1)蛋白质浸出
①水溶性蛋白质浸出:用0.05 molpH7.0的磷酸缓冲液(或蒸馏水)将样品制成匀浆液,然后离心15min(4000 r/min),收集上清液即蛋白质浸出液,再将沉淀物按上述操作重复两次。
②盐溶性蛋白质浸出用10%NaCl 将前者剩余沉淀物分离提取两次,收集蛋白质浸出液。
(2)蛋白质沉淀用0.1mol 醋酸将蛋白质浸出液pH 值调至蛋白质等电点(pH4.5左右),即8体积蛋白质浸出液加入1体积0.1 mol 醋酸,混匀,离心15min(3000 r/min),弃去上清液,沉淀物即为可溶性叶蛋白。
(3)蛋白质收集于沉淀物中加入95%乙醇,混匀,用定量滤纸过滤或抽滤,待风干后收集。
植物总蛋白的提取方法以有机盐沉淀法为主,本文中介绍到的(NH
4
)
2
SO
4
沉淀法、丙酮沉淀法、三氯乙酸—丙酮沉淀法和分步提取法,各个方法各有特点和适用范围,各位如有更好的植物总蛋白提取方法,欢迎补充。
分
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版主-zhang8826857
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