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转膜实验原理与操作步骤
省部重点实验室
2013/10/13
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生命科学仪器综合讨论
转膜是把DNA从琼脂糖凝胶中转移到固相支持物(一般是尼龙膜)上固定,是进行各种后续研究(如 RFLP 分析,阳性克隆的筛选验证等所有涉及分子杂交的研究)的前提。
实验目的:
掌握 Southern blotting 的原理及操作步骤
实验原理:
1. 转膜的方式:
向上的毛细管转移
向下的毛细管转移
同时向两张膜转移
电转移
真空转移
2. 固相支持物的种类及选择:
硝酸纤维素膜:非共价结合,易脆,易丢失DNA , < 500 bp 的DNA 无效,转膜前的工作(从提高转膜效率,利于转膜后使用等)。
尼龙膜(带正电荷的)高强度,不易破损,具有较大的DNA 结合容量,它能够吸附变性DNA ,核酸以共价结合方式不可逆的结合在尼龙膜上。尼龙膜两边均有吸附DNA 的功能,无论用哪边均可以经久耐用,可反复利用 10 次以上( 10-20 次),经毛细管(毛细吸附)作用,把DNA 从凝胶上转到膜上。DNA 转到膜上是复制胶上的带型,在 80-100 ℃真空干燥 2-4 hrs ,即可固定DNA 。
3. 转移缓冲液( transfer buffer )的选择:
带正电荷的尼龙膜:可用高盐离子强度( SSC ),但不能充分发挥膜潜能; 0.4N NaOH ,共价结合DNA 是最大优点。
硝酸纤维膜:高盐离子强度促进DNA 与膜结合( 20 × SSC ),低盐离子强度导致小片段DNA 在转移过程中丢失, pH>9 ,DNA 不能与膜结合。
4. 转膜时间( duration of transfer )约 12 hrs。
取决于毛细管系统,DNA 大小,胶厚度 (<5 mm) 及浓度 (<1%) 。
DNA 分子量大小决定时间长短,部分去嘌呤减小DNA ,碱转移 2hrs 大部分结合到膜。
DNA 转移的效率较难判断,只有在转膜结束后,通过 EB 染胶,及分子杂交才可以鉴别效率高低,但已无补救措施,因此,每一步应严格操作。
实验材料及试剂: 酶消化好的DNA 样品,尼龙膜, 0.2NHCl , 0.4N NaOH 等。
实验步骤:
1. 0.8% 琼脂糖电泳。
制胶:注意琼脂糖的质量,胶的浓度,厚度(<5mm)及均一性。一般大电泳槽配制 250ml 0.8% 琼脂糖凝胶,采用 42 孔梳子(经济,高效)。
制样,点样:DNA 样品中指示剂量稍多。
电泳:一般 1-1.5V/cm 的电压,使DNA 迁移到适当距离,一般指示剂约移动 10-11cm ( 大电泳槽: 40V × 12-15hrs ,小电泳槽 30V × 4-5 hrs)。
2. 转膜前的准备:
依胶大小每块凝胶准备两张比胶稍大的滤纸( 11 × 12.5 cm ),两张用作盐桥的滤纸,一张与胶同样大小的尼龙膜( 10 × 10.5cm ),两个玻璃盘、两块有机玻璃板、一根玻璃棒,比尼龙膜稍大的一叠吸水纸等。
3. 一玻璃盘中加入足量的 0.4N NaOH ,放上洗净的玻璃板,搭制盐桥。
4. 凝胶的预处理:
a.从电泳槽中移出凝胶置于塑料板上,用切胶板把胶切成适当大小,切去右上角(最后一个样品的最前端)作为电泳方向记号。
b.把凝胶翻面,放入加有足量 0.2N HCl 的玻璃盘中,轻轻摇动 10min ,使指示剂变黄色为止(脱嘌呤)。
c.倒去 HCl 溶液,加蒸馏水漂洗凝胶。
d.倒去蒸馏水,加 0.4N NaOH 中和。
e.同时在盐桥滤纸上洒些 0.4 NaOH ,立即将胶放在盐桥上(忌气泡)。
5. 胶的四周用塑料片与胶紧紧相连,防止短路(吸水纸与盐桥相接)。
6. 在胶面上倒足够量 0.4N NaOH ,小心放置膜(预湿 0.4N NaOH )使膜覆盖整块胶(要求一次成功,不能移动)。
7. 膜上放 2 张滤纸,滤纸大小为 15 × 12 cm。
8. 放不少于 5 cm 厚的吸水纸,放上玻板,其上压约 500g 的重物,转膜 12 hrs 左右。
9. 转膜完毕,用 2 × SSC 漂洗膜两次,各 5min 。用 EB 染胶以检测转移效果。
10. 用两张滤纸包住膜,置于 80-100 ℃的真空干燥箱中,干燥 2-4 hrs 。
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