单抗制备常见问题分析

省部重点实验室

2013/11/26

私聊

生命科学仪器综合讨论

1. 为什么免疫后没有效价或免疫后效价低？

答：可以从这几个方面一一考虑：

（1）设计的抗原与被免疫的动物内源蛋白有极高的同源性或者抗原是免疫原性极差的小分子物质。对于前一种情况应该重新设计抗原，设计抗原时尽量选取目标蛋白特异性的序列，可以设计为短肽然后再与载体蛋白偶联之后免疫；对于后一种情况，首先确认小分子物质是否已经正确地和载体蛋白偶联，如果偶联没有问题，可以更换其它的载体蛋白，一般来说KLH是所有载体中较为优先考虑的蛋白。

（2）免疫的周期不正确。免疫周期过长或过短，各免疫步骤之间的间隔过长或过短都有可能影响免疫效果，详细请参考本站有关动物免疫的部份，实际操作中的相关程序与本站推荐的程序相差尽里不超过50%的偏差。

（3）免疫佐剂不合适。TiterMax等佐剂在免疫时，对于某些抗原可能效果不佳，弗低佐剂也不能保证完全有效，此时可以考虑更换佐剂尝试。

（4）免疫剂量不合理。过大的免疫剂量可能导致免疫耐受，过少的免疫剂量可能无法激活免疫应答。一般来说，实际免疫剂量与本站所推荐的剂量不要相差两倍以上。

（5）免疫途径不合理。对于有些免疫原性弱的抗原，可以考虑脾内免疫方法，具体操作本站上也有详细的讲解。

（6）测效价的过程存在错误操作，尤其考虑包被是否成功或二抗使用是否正确。同时，一抗（即血清）稀释梯度尽量放宽，一般建议从1：500或1：1000开始作梯度稀释。对于小分子物质，效价达到1：2000仍可视为免疫成功。

2. 为什么融合后细胞不长或者融合后克隆很少？

答：可以从这几个方面考虑：

（1）免疫用的动物品系不正确或者品系不纯。免疫用的动物一般应该与骨髓瘤来源的动物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤细胞时应该选用Balb/C小鼠，同时必须使用品系纯正的小鼠。

（2）培养基中加入了过高浓度的HAT，或者仅A的浓度过高或HT的浓度过低，建议用纯的骨髓瘤和已有的杂交瘤作HAT浓度筛选。

（3）培养基不正确或血清浓度不正确或使用了劣质血清。

（4）未正确制备饲养层细胞。参见本站有关饲养层细胞制备的部份。

（5）接种杂交瘤细胞的培养板过多。一般在5-20块96孔板为宜。

（6）融合后，未及时转移或稀释细胞。有人在做融合后喜欢把融合的细胞先放在培养瓶中培养，然后再滴到96孔板上。如果在培养瓶中培养的时间过长，也可能出现克隆利率少的情况。

（7）细胞被污染。在显微镜下仔细观察是否有明显的微生物污染。即使看不到有明显的微生物，也应该考虑是否有支原体污染，有条件的可以做支原体检测。

（8）细胞培养条件不正确，确保细胞培养在恒定的37度较湿的环境，同时保证CO₂浓度在4-5%左右。

（9）其它与融合条件相关的不恰当的因素。详见本站有关细胞融合的部份。

3. 为什么融合后得不到阳性克隆？

答：可能的原因：

（1）动物未免疫成功就进行了融合。具体解决方法参照本页面第1个问题。

（2）融合后得到的克隆较少，故得到阳性克隆的机率也较小。具体解决方法，请参照本页面第2个问题。

（3）筛选克隆手段不正确。例如有些小分子物质不可以直接包被到酶标板上，再如使用了不适当的二抗等诸多因素，也有人直接不使用ELISA作为筛选方法的，成功率也有待商榷。

（4）抗原成份与细胞培养条件中的物质相同或类似，或者与筛选过程中有同抗原结构相同或类似的物质产生了竞争反应。举个简单的例子，如果需要制备抗BSA的单抗，则养杂交瘤的培养基中不可以使用牛血清，否则牛血清中的BSA直接与抗体相结合，最后做ELISA筛选的时候无法得到阳性结果。解决的办法只有使用其它的动物的血清或者使用无血清培养基。再如，如果需要制备酪蛋白的单抗，则做ELISA筛选时，二抗的稀释液不可以使用脱脂奶粉。

（5）其它所有能影响ELISA等相关筛选手段的因素。这一部份详见本站有关ELISA实验的讲解与讨论。

4. 为什么我的细胞生长很慢？

答：可能的原因：

（1）使用了劣质的培养耗材、培养基、血清、HAT或HT。建议新手使用知名厂商的试剂或耗材。对于血清，可能需要从多个厂家选用多个批次试用，选择出比较好的批次进行实验。在试用血清的时候，一般可以使用相对较低浓度的血清进行骨髓瘤细胞培养实验，根据骨髓瘤细胞的倍增速度确实血清质量。

（2）使用的血清或培养基浓度不正确。仔细检查配方是否正确。

（3）制备饲养层的方法不正确。参见本页面第二个问题。

（4）其它问题，可以参考本页面第二个问题。

5. 我的克隆原来是阳性的，为什么后来转为阴性了？

答：首先要注意的是，正常情况下，杂交瘤也不是绝对稳定的，确实容易发生染色体丢失的情况，尤其是当细胞移到新环境中生长，如从小孔扩大到大孔，或者复苏操作时，更容易发生阳性变为阴性。但是也有一些办法尽量减少阳性变为阴性的办法。一般可以从这几个方面加以注意：

（1）永远保证细胞处在最佳的生长环境中。尤其是培养基不能长期不换，一般来说，当细胞增长到一定密度的时候，培养基就开始变颜色，这个时候就要准备换培养基了，除了换培养基，同时应该控制好细胞的密度，可以吹走过多的细胞，使新加入的培养基不至于很快被消耗。

（2）对于重要的细胞株，每一步都把阳性的细胞保种。

（3）不要过于频繁操作细胞，当细胞生长密度不是很大的时候，不要频繁操作，否则细胞容易出现死亡或者生长形态发生明显变化。

（4）对于传代次数较多的细胞株需要经常进行亚克隆，并将每一次的亚克隆株也作冻存。

（5）当细胞被支原体等微生物污染，也会发生由阳性转为阴性的情况。

6. 为什么我做亚克隆后长不出克隆来？

答：亚克隆失败的原因和克隆不长的原因类似，但是除此之外，也还有一些独特的原因。

（1）亚克隆时，原始孔里的细胞状态不好，经过有限稀释或其它手段亚克隆的细胞活性很差，以至于长不出克隆。

（2)亚克隆时，没有按照正确的数量取出细胞，在本站有关亚克隆操作的页面上提到过，亚克隆的过程服从泊松分布，如果取出的细胞远远低于平均每孔一个细胞，或有效细胞远远低于平均每孔一个细胞，则也可能出现长不出克隆的结果。

（3）未添加饲养层细胞。单个细胞在完全培养基中极难培养，如果不添加饲养层细胞，则它们很可能很快就死亡，最终就长不出克隆。

（4）使用的HAT中HT失效或A的浓度过高，或者未添加HT。虽然HT对杂交瘤的生长并不是必须的，但是HT确实可以加快细胞生长，改善细胞生长状态。

（5）使用无血清培养基。这一点是很冷僻的一个因素。虽然很少有人使用无血清培养基制备单抗，但是在某些血清可能干预筛选步骤的实验的时候，可能会选用无血清培养基来培养杂交瘤，但是需要注意的是，在很多种无血清培养基中，单个细胞是很难长成克隆的。最好的解决办法就是先用含有血清的培养基培养它们，等克隆长出后再把培养基彻底更换为无血清培养基。

7. 为什么我冻存的细胞很难复苏或者复苏不活？

答：这个问题要从两个方面来回答，一是冻存方面，二是复苏问题。对于冻存过程，需要注意：

（1）冻存液的配方。这个问题很关键，一个良好的冻存液配方可以使细胞保存得非常好，而一个不好的冻存液配方可能会让细胞倾刻死亡。目前认为比较好的配方有：10%DMSO+90%胎牛血清和10%DMSO+90%养过杂交瘤的培养基，不管是哪一种，冻存保护剂DMSO的含量非常重要，如果这个浓度过低，则起不到保护作用，冻存的细胞最终会死于冰晶形成时的张力，如果浓度过高，则细胞中毒而亡。如果使用第二个配方，注意一定要用养过杂交瘤的培养基，而尽量不要用一般的完全培养基，而且一定是配养需要冻存的那一株的培养基。文献中也有提到用甘油作为冻存保护剂的，站长自己没有亲自试过，不发表评论。如果新手确实对这个没把握，市场上也有商品化的冻存液，买回来按照说明书操作就OK了。

（2）冻存过程中，不可用力过大，在冻存液中重悬细胞的时候更是要轻柔，因为在DMSO存在的条件下，细胞膜变得非常脆弱，如果用力过猛，则细胞膜很容易破，复苏成活的机会就明显会下降。

（3）冻存的程序也非常重要。实践表明，以每分钟1 ℃的速度下降冻存细胞是最理想的。如果条件简易，可以把细胞放在4 ℃半小时左右，然后再在-20 ℃放置1-2小时，最后转入-80 ℃放置过夜，最终转入液氮保存。需要短期保存的，直接放-80 ℃也行。现在市场上有比较贵的冻存盒，把需要存放的细胞放进去，然后直接放-80 ℃就行，等时间够长后直接转至液氮中即可。

（4）细胞需要保存在液氮的气相中，而不是泡在液相里。否则液氮很容易进入冻存管。这一点很多人都没有注意，大部份人都是直接往液相里放，其实这是错误的。有人认为，普通的液氮中可能含有微生物或者孢子什么的，如果放在液相中，这些微生物或孢子就有机会进入冻存管，最终可能造成细胞污染。

（5）保证被冻存的细胞处于良好的生长状态，并且没有被污染。

对于复苏过程，需要注意：

（1）快速。为了防止升温中细胞内产生冰晶，强烈建议加快融化过程。一般都要用用足够体积的37 ℃热水复苏，并不断晃动冻存管。

（2）复苏过程不要把冻存管全部泡入水中，也不要把盖子弄湿，否则热水有可能污染管口，造成复苏的细胞被污染。

（3）有的人复苏细胞时，没有去掉冻存液，这样就把冻存液里的DMSO带到了新的培养体系里，容易对细胞造成毒害，因此强烈建议将融化的细胞离心后去掉冻存液，然后用新的完全培养基重悬，再接种到新的容器内培养。

8. 为什么我的细胞总是污染？如何可以救活污染的细胞？

答：养细胞出现污染，几乎是每个细胞培养技术员容易出现的问题。要防止细胞污染，无非就是保证培养环境无污染，保证所用的所有试剂都无污染源，同时提高操作时的警惕性，这些基本的知识这里就不再废话了。下面讲一讲如何挽救一株已经被污染的细胞株。

（1）体外用抗生素消灭。一般来说，一旦发现细胞被微生物污染，应该马上进行处理，也许还有一线挽救的机会。但是这种挽救不是盲目的，首先应该决断是哪一类生物造成的污染。细胞的污染大致可以分三类：细菌污染、真菌污染和支原体污染。在显微镜下仔细观察，这三种微生物污染区别还是比较明显的：如果有大量运动的微生物，且形态较大，轮廓清晰可见，呈较大幅度运动，并且培养基在短时间内变酸，则很可能是细菌污染；如果在显微镜下观察有典型的斑状或丝状微生物（注意与塑料屑、棉花屑和琉璃纤维区别开），基本上看不到明显的运动，则很可能是真菌污染；如果看不到明显的微生物，并且培养基没有明显的颜色上的变化，而细胞状态很差，细胞边缘极其不光滑，而且细胞又莫名其妙地死亡或生长极其缓慢，则有可能为支原体污染，但不能下明确的结论，如果非常需要知道是否为支原体污染可以使用相关的试剂盒进行检测。对于细菌或真菌的污染，可以先把细胞收集起来，用干净的培养基洗涤离心，交替进行几次，再把洗干净的细胞放在新的培养板或培养瓶等容器内，加高浓度的抗生素培养，同时强烈建议加入小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养层，以辅助消除微生物。对于细菌污染，可以把青霉素的浓度提高至10倍左右，链霉素浓度提高至5-10倍，也可以用10倍浓度的卡那霉素替代链霉素。对于真菌污染，可以在培养基中加入约5 ug/ml的咪康唑（注射用达克宁）抑制。对于这两种情况的污染，采用上述方法处理后，待细胞稍有好转，并且没有发现更大规模的污染时，需要尽快重复上面的处理步骤。需要注意的是，此时细胞生长受抗生素的影响比较大故而生长很慢。如果多次传代均未发现污染复发，可以慢慢降低抗生素浓度直至常规浓度，确定是否完全根除污染。最好进行一次有限稀释的亚克隆操作，以获得更加纯净的细胞株。而对于支原体污染，则比较麻烦，一般的抗生素是很难解决的，对于轻度的污染，可以试试使用60 ug/ml的泰乐菌素和10 ug/ml左右的环丙沙星交替处理。如果得到明显的缓解，建议马上做亚克隆操作，看看是否得到污染根除的细胞株，如果此方法无效，则不能单纯利用抗生素来解决污染问题。

（2）体内法。这个办法很简单，原理就是动物体有强大的免疫系统，一般的微生物都可以被动物体消灭。具体操作和制备腹水的方法完全一样，即先用IFA或石蜡制敏小鼠，数天后腹腔注射污染的杂交瘤。如果情况紧急，致敏当天注射杂交瘤也行。一般十天后小鼠产生腹水，在超净台无菌采出腹水，其中即含有大量的杂交瘤细胞，一般是可以除掉污染的微生物的。也可以在小鼠背部注射杂交瘤，十几天后可以看到实体瘤形成，也可以在超净台上无菌采摘，然后放回培养板或培养瓶等容器内培养。如果被污染的细胞很少，比如说在96孔板上就被污染了，这时候不能进行腹腔注射，也不要进行皮下注射，否则细胞很容易被老鼠的免疫系统攻击而死亡的，最好的办法是采用脾内注射的方法进行，同时在腹腔内用IFA或石蜡油致敏，十几天后，同样可以形成腹水，其中即含有干净的杂交瘤细胞。如果担心小鼠会受到微生物感染，可以在培养基中先加入高浓度的抗生素，然后连同抗生素一起注射到小鼠体内。

如果确定细胞污染极其严重，并且细胞已大面积死亡，建议放弃，迅速做好环境清洁工作，对细胞操作间作彻底消毒，重新做融合而获得新的细胞株，不可因小失大造成其它的细胞也被污染。

9. 为什么我的杂交瘤细胞不能制备腹水或者制备的腹水中没的抗体或腹水没有效价？

答：不能制备腹水的原因大部份是人为的原因：

（1）致敏不正确，例如使用了不正确的致敏剂，或者致敏时间与接种杂交瘤的时间相差太久。

（2）杂交瘤的接种位置不正确，没有打到腹腔，而是打到了皮下。

（3）接种的杂交瘤细胞数量太少或者细胞状态不好。一般不应少于10万个细胞，建议在100万个细胞左右为宜。

（4）制备腹水小鼠的种系与参与融合的细胞来源的动物种系相差太远，以至制备腹水的小鼠对杂交瘤有强大的免疫反应将其杀死，建议更换小鼠品系重新接种。

对于腹水没有效价，可能的原因：

（1）制备腹水的杂交瘤极不稳定，打到小鼠身上之前就失去抗体分泌能力或者打到腹腔内就失去了分泌能力。

（2）致敏小鼠时采用了错误的致敏剂，如使用了弗氏完全佐剂，这时即使不打杂交瘤，小鼠也会产生腹水。

（3)极其罕见的情况，就是此杂交瘤生产的抗体可以与小鼠体内的分子相互作用，于是杂交瘤产生的抗体被小鼠的相关蛋白中和，这种情况下，小鼠的身体可能会出现明显的异常。

（4）检测腹水效价的实验方案有问题，或者腹水稀释比过大。

10. 免疫失败的可能原因及应采取的措施

答：有时不能获得满意的抗血清，可从下列几方面找原因，并改进之。

（1）免疫动物的种属及品系是否合适，可考虑改变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数量。

（2）抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。

（3）制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂，载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进。

（4）所用的佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其它佐剂，或加强乳化。

（5）免疫的方法、剂量，加强免疫的间隔时间和次数，免疫的途径是否合适。

（6）动物的饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。

11. 制备单克隆抗体影响因素、失败原因分析

答：由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。其主要失败原因和影响因素有：

（1）污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。

（2）融合后杂交瘤不生长，在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素：

PEG有毒性或作用时间过长。

牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。

骨髓瘤细胞污染了支原体。

HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。

（3）杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体：融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。Goding91982）曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。

三要：

要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。

要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。

要定期进行再克隆。

三不要：

不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。

不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。

不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。

（4）杂交瘤细胞难以克隆化

可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。

分
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