化妆品中补骨脂特征成分补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄酮的检测方法

5 测定步骤
5.1 样品预处理
　　膏、霜、乳类：称取0.5 g（精确至0.1 mg）样品，置10 mL量瓶中，加6 mL甲醇，涡旋振荡使试样与提取溶剂充分混匀，超声提取20 min，放至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，转移至10 mL具塞塑料离心管中，以12000 r/min离心5 min，上清液经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为待测溶液备用。
　　液体类：称取0.5 g（精确至0.1 mg）样品，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀，必要时，转移至10 mL具塞塑料离心管中，以12000 r/min离心5 min，上清液经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为待测溶液备用。
　　固体粉类：称取0.5 g（精确至0.1 mg）样品，置10 mL量瓶中，加8 mL甲醇，混匀，超声提取20 min，放至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，静置，必要时，转移至10 mL具塞塑料离心管中，以12000 r/min离心5 min，上清液经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为待测溶液备用。
5.2 高效液相色谱参考条件
　　色谱柱：C18柱（100 mm×4.6 mm，3 μm，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂）或具有同等柱效的色谱柱；
　　流动相：乙腈＋0.1%醋酸水溶液，梯度洗脱，洗脱程序见表1。

注：梯度洗脱条件，操作者可根据样品的不同选择最佳条件，使4种成分与其他组分峰获得完全分离。
　　流速：1.0 mL/min。
　　检测波长：246 nm。
　　柱温：30℃。
　　进样量：10 μL。
5.3 样品测定
　　按设定的色谱条件（5.2），取补骨脂特征性成分混合标准溶液（3.7）进样，进行高效液相色谱分析，记录各色谱峰相应的保留时间和紫外光谱图；取补骨脂标准储备溶液（3.8）进行高效液相色谱分析，记录各色谱峰相应的保留时间和紫外光谱图。取待测溶液（5.1）进样10 μL分析，若样品色谱图中，在与补骨脂特征性成分--补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄酮对照品相应保留时间处有相同色谱峰出现，且具有相同的紫外光谱，则可以定性鉴别补骨脂特征性成分补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄酮的存在。
5.4 平行试验
按以上步骤操作，对同一样品独立进行测定，获得的两次独立测试的色谱峰保留时间不得超过±1 min。
5.5 阳性结果确证
　　测定过程中若补骨脂素和异补骨脂素检出阳性结果，而新补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄酮低于检出限，可适当富集样品对新补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄酮的检测进一步确证。

6 精密度、稳定性和重复性
　　高、低两个浓度水平的补骨脂标准储备溶液的精密度、稳定性和重复性，在不同空白基质中，补骨脂素和异补骨脂素、新补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄酮4种特征性成分的保留时间和峰面积的RSD均小于5%（n=6）。

7 色谱图

图1 4种补骨脂特征成分混合标准溶液（10 μg/ mL）HPLC色谱图


图2 补骨脂标准溶液（2 mg/mL）HPLC色谱图
色谱峰：1. 补骨脂素，2. 异补骨脂素，3. 新补骨脂异黄酮，4. 补骨脂二氢黄酮