沙门氏菌检测方法的研究进展

1 沙门氏菌的生物学特性
沙门氏菌是革兰阴性杆菌，大小0.6-1.0×2-4um。有菌毛。除鸡沙门菌和雏鸭沙门菌等个别例外，都有周身鞭毛。一般无荚膜。均无芽孢。兼性厌氧，营养要求不高。[1]
2 沙门氏茵的危害
沙门氏菌被认为是目前世界范围内最重要的食源性致病菌之一。食物传播是人类感染沙门氏菌的主要途经，肉类(尤其是禽肉)、蛋类及蛋制品、未经巴氏消毒的牛奶及奶制品、海产品等很多食品都与沙门氏菌病有关。人类沙门氏菌病的特征是恶心、呕吐、腹泻、腹痛或痉孪、发烧及头痛。潜伏期从8h一72h不等。患者通常在进食受污染的食物12h一36h后发病。症状可能长达一个星期。[2]
3检测方法
3．1传统标准检测方法
用于沙门氏菌分析的传统方法是食物样品分步增菌，以增加病原的可检出率。这种培养方法总体可分为以下几个不同阶段或步骤。第一步是预增菌，将样品加到一种高营养、无选择性的培养基中，温度37℃，使那些“致伤”的细菌复苏及使所有微生物生长。第二步是选择性增菌步骤，它使沙门氏菌生长而使肉汤中同时存在的微生物数量减少，与预增菌培养基相似，目前应用的主要为缓冲蛋白胨水。[3]第三步是分离步骤，即选择性培养物在含一种或多种抑制非沙门氏菌生长制剂的琼脂平板上划线培养，然后对平板上肉眼可见的特征性菌落进行确认，并对该菌落分离物进行一系列生化和血清学检测，做出鉴定。[4]
虽然该方法是迄今为止最确切的方法，但是由于贮存、切割等原因，食物中的沙门氏菌可以是间歇的和低密度的，所以有时必须重复分离并采集大量样品在增菌肉汤中进行培养。传统沙门氏菌检测方法全过程需时至少4—6d，才能确定。并且检验程序复杂繁琐、耗时费力。从实验人员方面来看，挑取单菌落、手工生化鉴定等许多步骤依靠操作者的主观判断，因此要求检测者有丰富的检测经验，检验结果是否准确可靠在很大程度上依赖检测者的专业素质和实验时的工作状态。所以该方法不够客观、简便、省时、快速。
3．2聚合酶链反应技术(PCR)
作为分子生物学方法，PCR法具有快速、简便、灵敏的特点，是检测沙门氏菌的发展方向。沙门氏菌属有许多种血清型，因此不同的血清型具有不同的靶基因，如靶基因invA、invE、hns、hut、hilA、phoP等。inv基因簇是沙门氏菌属的特异性引物基因，具有属特异性，其中包括invA、invB、invC、invD、invE。
3．2．1常规PCR
本试验对已知被沙门氏菌污染的样品都能扩增出来662bp的特异亮带；对未知污染状况的样品进行检测，发现有2个样品被沙门氏菌污染，说明PCR方法用于检测样品中的沙门氏菌，结果可靠。同时对样品DNA含量，进行梯度稀释，取不同稀释度的样品进行PCR扩增，当DNA含量只有0．01pg时，还能扩增出条带，说明PCR扩增检测沙门氏菌的灵敏度极高。[5]
用PCR的方法检测食品中的沙门氏菌，敏感性高、特异性强、快速、准确、结果分析简单，对待样品要求不高，检测时间短，但费用高、操作复杂、操作中的残留污染易导致假阴性和假阳性，而且需要专用仪器设备，对基层检验人员来说可操作性较差。在PCR的基础上发展了多重PCR方法检测沙门氏菌。利用多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其血清型及突变等，降低检测时间。但是使用多重PCR时应注意对不同的引物退火温度加以区别，内在的或扩增的物质均可阻碍PCR分析这一点。
3．2．2 RT—PCR(Real—Time PCR)
Bmkhard Malomy等人以肠炎沙门氏菌特异性inv A基因序列为模板，设计引物和inv A探针。该实验所有污染样品通过RT—PCR均被检测出来，结果均为阳性⋯。
沙门氏菌实时定量PCR检测技术保留了常规PCR检测的特异性和敏感性，整个过程由电脑控制，从加样到结果只需要2h左右。可同步完成多个样品的扩增及定量，适宜于大批样品的检测处理，极大地提高了检测效率，为食品污染的监测和食物中毒事件的快速反应提供了技术支持。尽管实时定量PCR检测比较昂贵，但由于其能对样品中细菌的污染程度进行定性及定量分析，且灵敏度高于传统PCR，更易于自动化，将来必然会成为细菌检测的常用方法。
3．2．3随机扩增多态性DNA技术(RAPD)
RAPD(Randomly Amplified Polymorpnie DNA，简称AFLP)技术方便快速，实验结果既稳定又可靠。因此，在微生物研究领域有着极为广泛的应用。RAPD在菌株的遗传变异上是强有力的工具，可以区分其他方法无法区分的不同菌株。由于RAPD技术比其他的PCR技术需要的引物碱基序列少，因此具有操作简便、经济、快速等优点。同时由于它无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序，引物是随机合成或是任意选定的，因此，作为高通量的分子研究工具RAPD技术来研究某一特定的生物种时，RAPD图谱仍然处于缺乏状态。
3．3免疫学方法
3．3．1酶联免疫吸附
酶联免疫吸附测定法(简称ELISA)。ELISA的基本原理是把抗原或抗体预先结合在某种固相载体表面，然后加入受检样品和酶标抗原或抗体使其与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原抗体复合物，经洗涤去除反应液中其他物质，加入酶反应底物后，底物被固相载体上的酶催化变为有色产物，最后通过定性或定量分析有色产物即可确定样品中待测物质含量。该方法是将细菌经离心之后，转移到醋酸纤维薄膜上，然后放在多孔板中固定，加抗沙门氏菌的鞭毛抗体作用，再加第二酶标抗体作用，最后以底物显色，产棕色或蓝色为阳性。这种方法最小检出量可达104—105 CFU／ml，其缺点是会引起假阳性反应。
3．3．2免疫荧光标记
免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
用自动荧光抗体检测系统检测食品中的沙门氏菌，每小时能检测到120个玻片样品，与常规试验比较，准确率达96％。该系统可同时检测14个样品，并且结果可靠，操作简单。利用表面吸附将检测样品吸附于载于玻璃表面的一种薄膜上，然后用免疫荧光显微镜进行结果判定。该方法检测限为103-5/ml 个沙门氏菌，且不呈现假阴性与假
阳性反应。
4 讨论
4．1存在问题
目前对沙门氏菌检测大多采用细菌分离、生化鉴定等表型方法，过程烦琐、费时费力，并且肠杆菌科细菌间的生化反应多有交叉，因此，表型检测方法在快速、敏感与特异性等方面有自身的局限性；分子生物学检测方法虽然具备敏感性高、特异性强、快速、准确等优点，但是费用高，易污染，对操作环境要求较高，无法成为通用的检测方法。
4．2应对措施
传统的沙门氏菌检测方法需不断改进，其改进内容主要集中在选择性培养基的选择上。如由于沙门氏菌具有可特异性地分解丙烯乙二醇产酸，使中性红指示剂变红的生化特征，在分离培养基中加入丙烯乙二醇、5一溴一4一氯一3一吲哚一β一D呋喃半乳糖，可实现对沙门氏菌的分离与鉴定工作同步进行，使沙门氏菌检测所需时间从常规方法的4—6 d缩短至2 d；分子生物学方法也需不断改进，常规的PCR方法虽然符合快速简便等要求，但是它易污染，假阳性高。相比之下，RT—PCR不仅克服了PCR的缺点，而且具有操作简单、结果直观、可靠、特异性强、灵敏度高、可定量等优点。因而成为越来越重要的一种检测手段。

4结语与展望
沙门氏菌是一种人畜共患的病原菌，能引发人类的沙门氏菌病。建立一种行之有效的食源性沙门氏菌的定量检测方法，以提高对该菌的检测速度和准确性，使受污染的食品得到及时处理，在公共卫生、食品卫生、畜牧兽医和口岸检疫等中都有重要意义。
沙门氏菌的检测方法有很多，主要有传统的细菌培养，PCR，免疫学方法等。传统的细菌培养程序繁琐，至少需要4～6d才能得出结论，难以适应快速简便的要求。常规的PCR方法虽然符合快速简便等要求，但是它易污染，假阳性高。相比之下，RT—PCR不仅克服了PCR的缺点，而且具有操作简单、结果直观、可靠、特异性强、灵敏度高、可定量等优点。因而成为越来越重要的一种检测手段。
参考文献：
[1] 李凡，刘晶星 主编《医学微生物学》第7版。
[2]王军，郑增忍，王晶钰．动物源性食品中沙门氏茵的风险评估[J]．中国动物检疫，2007，24(4)：23—25．
[3]食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 GB4789.4-2010
[4]吕晓红，任红．浅谈食品沙门氏菌的检测方法[J]．畜产安全，2006，8(24)：24—25．
[5]邵碧英，陈彬，汤敏荚．沙门氏菌多重PCR检测方法的建立[J]．食
品科学，2007，28(1)：489—492．

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