高效液相色谱法测定生物体内乙醛含量的方法

阿三

2014/08/29

私聊

液相色谱（LC）

高效液相色谱法测定生物体内乙醛含量的方法

摘要：在机体中乙醛是由乙醇在肝脏代谢中通过醇脱氢酶生成的，在肝脏其迅速通过氧化酶转变为乙酸。乙醛循环水平的生物基质的评估通常是通过顶空气相色谱法和反相高效液相色谱法进行的。

本实验对乙醛测定方法进行了优化,通过RP-HPLC法测定肝癌细胞培养基，血液和血浆中的乙醛。样品除蛋白后，加入2,4 - 二硝基苯肼（DNPH）使之与乙醛衍生化。在反应中本实验对于衍生化试剂的pH值，反应时间时间和温度，衍生化试剂的量进行了考察优化，并对乙醛腙（ACH-DPN）衍生物的提取方法及其稳定性进行了研究。

结果：本实验确定了在pH =4.0的情况下加入80倍过量2,4 - 二硝基苯肼（DNPH），反应在室温下进行40分钟即可，衍生化产物在室温下两天内稳定，在确定的色谱条件下DNPH 和ACH-DPN 11分钟内可以得到很好的分离，检测限可以达到80μM.

前言：人体摄入酒精后，乙醛循环的水平取决于乙醛形成和消除的速率，乙醛主要是乙醇在乙醇脱氢酶的的作用下氧化生成，另有少量来自于微粒体乙醇氧化系统和过氧化氢酶对乙醇的氧化作用。乙醛再在乙醛脱氢酶的作用下生成乙酸。人体和大鼠中体内的乙醛的消除几乎都在肝脏线粒体内进行。生物体进食酒精后，组织和体液中低摩尔水平的乙醛是可以检测到的。测定体内乙醛含量非常困难，这是由于其成分复杂性、乙醛含量的波动性以及极低的限量。

高效液相色谱方法需要衍生化试剂来标定和稳定乙醛，大部分的衍生化试剂都基于与乙醛的醛基反应。在本实验中样品通过脱蛋白后进行衍生再萃取，通过反相C18柱进行有效分离，优选的液相洗脱系统保证了其他物质的干扰。

仪器和试剂：安捷伦液相1200配DAD检测器、Eclipse XDB-C18-USP L1分析柱（规格(mm):4.6＊150粒径:5μm），恒温水浴锅（上海）乙醛，DNPH和醋酸钠（上海嵘崴达实业有限公司）、AcH-DNP (1 mg/ml)（美国进口）乙腈（色谱纯）、三氟乙酸、盐酸、高氯酸、、Eagle培养基、胎牛血清（FBS），马血清和0.25％胰蛋白酶-EDTA（上海浩然生物技术有限公司）、人肝癌细胞（上海拜力）。

乙醛ACH-DNP的衍生和提取
取70 μl样品用两倍体积的高氯酸进行第一脱蛋白质。然后用乙酸钠调节pH为4，离心（1500转每分，10分钟，4℃），将上清液转移至冷管中。DNPH溶解于6N 盐酸，加入80倍摩尔过量DNPH 进行衍生化反应1小时，在22℃下振荡。衍生化反应结束后加入三倍体积的乙酸钠缓冲液（pH=9），衍生化反应的效率通过调节不同的pH值、反应温度、反应时间、DNPH的用量进行考察得出。

AcH-DNP产物通过SEP-PAK C18固相萃取柱进行萃取，未反应的DNPH用水冲洗掉，然后用70％甲醇水冲洗;最后用甲醇将 ACH-DNP洗脱下来。甲醇提取物进行低温下干燥立即测定或者保存于在-20℃的环境中备用。

液相系统：衍生化样品以50%乙腈溶解，进样量20μl，柱温28℃，流速1ml/分,检测波长360nm，另外215nm波长用于检测确保除蛋白效果。流动相A 0.1% TFA/water (v/v)流动相B 0.1% TFA/AcN (v/v),以40% B/60% A进行洗脱。AcH-DNP对照品溶解于40%乙腈中，外标法测定。

肝癌细胞：肝癌细胞的DMEM培养基含有10％FBS，5％CO₂，在37℃的条件下进行。加入25%的乙醇于细胞培养基中，密闭条件下放置24小时，在测定乙醛含量时细胞聚集率达到50%，在温育期结束时，将培养瓶转移到 4℃下持续30分钟，以确保乙醛从气相转移到到液相中。然后将培养基转移至冷管、脱蛋白、衍生化，进行测定。

大鼠血液和血浆：雄性SD大鼠来自本单位动物饲养室，经麻醉后，用涂有肝素的真空采血管心脏取血，然后迅速离心（1500转/分，10分钟，4℃），全血和血浆分别加入50μM乙醛并且加入20mM乙醇的空白和对照，样品用3M高氯酸进行脱蛋白并离心然后衍生化，萃取后通过HPLC立即测定。

讨论：生物体的乙醛水平的精确测定非常重要，因为乙醇第一代谢产物在提示一些疾病（如癌症、心肌病、肌肉病变、和成瘾性疾病）有非常重要的价值。而且对于一些缺乏ALDH₂编码的酶的亚洲人，当摄入酒精后乙醛水平也会升高，可以使用药物如双硫仑抑制ALDH₂来使人对酒反感、增加乙醛水平，达到戒酒的目的。所以新的戒酒药物的开发就是靶向ALDH2基因使人厌酒，于是对于组织内乙醛的定量测定就显得尤为重要。

低温采样是为了避免在衍生化之前乙醛从样品中挥发而导致实验数据误差；经过试验发现衍生化反应对于环境pH值敏感，酸性条件下最快，最佳pH值为4；本液相系统采用乙腈水作为流动相不仅考虑到其得到的优良色谱行为，还由于在波长低至200nm时乙腈具有非常低的吸收率其允许在215nm处的肽键的分析，以再次确认样品除蛋白。

总之，本实验方法适合于摄酒后生物体内乙醛含量的精确测定，检测限量可达到80 μM，可以实现70 μl培养基或生物样品的检测。

附图1 样品的HPLC色谱图

附图2 乙醛衍生化反应与pH、反应时间、DNPH浓度的函数关系

附图3 ACH-DNP的稳定性

附图4 外加ACH-DNP于40%乙腈中的测定值标准曲线

（附小图：往培养基中定量加入乙醛所测得的标准曲

分
该帖子已被版主-老多_小多加20积分，加2经验;加分理由:原创大赛作品奖励