【资料】－高效液相色谱柱的管理

2.2 样品和固定相
如果有少量或微量的样品不能够溶解在流动相中,在通过固定相会堵塞柱子。样品中的颗粒杂质也会堵塞柱子。样品组分例如糖、蛋白质等通过柱子时会产生不可逆吸附,这样固定相的活性点被覆盖。样品组分还会与固定相产生反应,尤其是对于氨基柱的影响较为严重,因为氨基易与酐、酮形成希夫(Schiff)缩合而减少活性点,使保留时间缩短。色谱柱键合相基团脱落、固定相分解和活性基团变性以及会影响柱效和保留时间的显著改变。大多数键合相都是通过硅氧硅键(Si-O-Si)连接在硅基质上,形成带有有机基团的固定相Si-O-Si-R(R为CnH2n+1),硅氧硅键可能在水溶液中水解而断裂,使键合基团脱落。

3 高效液相色谱柱的管理
3.1 色谱柱的管理
制定色谱柱管理的标准操作规程并严格执行。每一根新购进的色谱柱必须造册登记,内容包括:生产公司、品名、型号、规格、购进时间、启用时间、单价、柱内保护溶液等。色谱柱分类存放,硅胶柱、化学键合硅胶柱、氰基或氨基柱、离子交换树脂柱、凝胶柱各用一个色谱柱盒,盒上贴上标签,注明类别。随柱说明书装入密实袋附在登记本上。每启用一根色谱柱,在色谱柱上贴上标签,注明启用日期。每根柱子每两个月保养一次,特别是对于一些使用频率少的柱子,因为放置时间长,容易干柱,每一次做好保养记录。对于确已失效的柱子,做好停用记录,不能随意丢弃,专门存放,如果现用的柱子的填料需要填补,可以用存放的柱子的填料。在从事生产的单位的质检部门,对于使用时间较长柱效降低的柱子,可把它用于检测产品的中间体。

3.2 色谱柱的保养
色谱柱使用一段时间后,常遇到柱子被污染,柱效会有一定程度的下降,采用适当的方法对色谱柱进行保护,可以延长色谱柱的使用寿命。
样品和流动相的处理:溶解的样品进样前用滤膜过滤,以除去不溶物。如果必要,需进行样品的预处理。流动相中如有不纯物质将影响柱效,所以溶剂尽量使用色谱级别的,至少是分析纯级别,流动相使用前用微孔薄膜过滤。在流动相的输液管前安装过滤器。过滤器定期用甲醇超声清洗,如果效果不好,可用10%的稀硝酸浸泡清洗。对于堵塞严重的过滤器,可在火焰上灼烧后再清洗。
保护柱(预柱)的使用:对于较昂贵的色谱柱,可以在柱前加一保护柱,防止样品中杂质污染分析柱,对于制备柱,因其进样量大,使用保护柱尤为重要。
常规处理:硅胶、氧化铝、极性键合相色谱柱每一次用完后用低流速长时间的二氯甲烷或正己烷等溶剂冲洗;键合相硅胶色谱柱、离子交换色谱柱和凝胶色谱柱先用蒸馏水冲洗,再用甲醇冲洗,然后用甲醇与蒸馏水以一定比例混合的溶液冲洗后过夜。

对于已使用一段时间后柱效下降的色谱柱可按以下方法进行再生。再生处理包括活化(右→左)和净化(左→右)两种。硅胶、氧化铝、极性键合相色谱柱按下列顺序冲洗:三甲基戊烷或己烷←→三氯乙烷←→乙酸乙脂←→丙酮←→乙醇←→水。键合相硅胶柱:蒸馏水←→甲醇(冲洗过程中可加入少量二甲基甲酰胺)。离子交换树脂柱:高浓度的NaCl溶液(1-2molL的NaCl溶液)可使大部分树脂再生,油脂等少数与树脂紧密结合的物质可用低浓度碱溶液(如0.1molL的NaOH溶液)冲洗,酸性有机物吸附在固定相的用低pH缓冲液冲洗,碱性有机物用高pH缓冲液冲洗,然后再用蒸馏水←→甲醇←→二氯甲烷←→甲醇←→蒸馏水冲洗。凝胶色谱柱:由于凝胶色谱柱是根据被分离物质的分子量大小而分离物质,通常用稀的氢氧化钠或非离子型去垢剂(0.2%-1%NP-40或Lubrol)冲洗可除去大部分的结合物质,如果一些污染物仍然不能清除时,用24%或30%乙腈冲洗过夜可除去疏水蛋白,用30%-50%乙酸可除去亲水蛋白,用蛋白水解酶处理可分解凝胶中剩余的痕量胃蛋白酶,然后再用蒸馏水←→甲醇←→蒸馏水冲洗。
已污染的色谱柱的处理:因保留强的物质污染,流动相或样品中不溶物沉积于柱头,可用下列方法洗涤:去除脂类可用四氢呋喃、乙腈或甲醇洗涤;去除蛋白质可用乙腈、丙醇和1%三氯乙酸进行梯度洗脱;一些高疏水性化合物可用乙腈或甲醇洗脱,同时反复注入100-200ml的四氢呋喃。
柱头处理:对于柱头堵塞污染严重的情况而且用溶剂冲洗无效的色谱柱,只有打开柱子去除柱顶的填料重装:先拆下不锈钢烧结过滤器,检查柱床,常见凹陷或受污染的带色填料,剔去不规则床层和带色填料,使柱床显白色并完全水平,再用甲醇作糊状填料匀浆液,将糊状填料匀浆液滴在柱上靠重力从匀浆液中排出甲醇液,重复直到填料水平。

柱子的贮存:首先柱子必须清洗干净后才能贮存,柱子不能贮存在水或水性溶剂中,否则会引起微生物的滋生。极性色谱柱可用适当溶剂如二氯甲烷冲洗;键合相色谱柱用甲醇冲洗;阴离子交换色谱柱用0.002%洗必泰(双氯苯双胍己烷)的缓冲液冲洗,阳离子交换色谱柱用0.005%硫柳汞缓冲液冲洗;凝胶色谱柱用缓冲液中加0.02%叠氮化钠或用20%乙醇冲洗。再将柱子两头密封,以防止溶剂蒸发使柱子干燥而引起柱子结构的几何学改变。

来源：谢 虹,刘秋朝,梁建生;高红明高效液相色谱柱的管理;实验室研究与探索; 2003年第22卷第3期:117-118(125)

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讲的很详细,需要长期研究!

再附上一篇相关的文献：
高效液相色谱柱的保护
王 新
摘 要:本文讨论流动相及样品对高效液相色谱柱的损害因素,探讨高效液相色谱柱的保护方法。
关键词:色谱柱;损害;高效液相色谱法

在高效液相色谱仪的使用中,保持高效液相色谱柱的柱效、容量和渗透特性,延长柱子的使用寿命非常重要。色谱柱用久后常出现柱压升高,柱效降低,峰形畸变,保留时间改变等变化,如不采取适当措施,色谱柱将无法再使用,缩短色谱柱的使用寿命,本文从影响色谱柱的外界因素出发,并考虑色谱柱固定相性质的变化,讨论流动相和样品对色谱柱造成损害的因素,探讨保护方法。

1 流动相对色谱柱的损害因素
颗粒杂质:目前广泛使用的柱填料直径多在10um以下,微小的颗粒杂质很容易使柱子发生堵塞,因此使用的溶剂应当过滤,柱子上端接头应当装微孔过滤片以阻挡颗粒物进入柱中。

水溶液中的微生物:以水溶液为流动相时,应防止细菌的生长,五氯酚、叠氮化钠、辛酸等能防止细菌生长。当用水溶液或有机酸缓冲液保护柱子时,一些厌氧霉菌可能在色谱柱中滋生,堵塞固定相颗粒间的空隙。

pH值:对硅胶基键合相填料,水溶液pH值不可超过2-7.5这一范围,当pH>8时,硅胶会释出
生成絮状物堵塞柱子,且难以复原,柱效很快降低,甚至完全失效。

盐类析出:当在流动相缓冲液中加入和水混溶的有机溶剂时,其中的盐类溶解度下降,可析出盐类沉淀,堵塞柱子;加入粘度不同的样品溶液也可能发生类似现象。所以缓冲液中盐的浓度宜低,样品提取液的组成应和流动相匹配。

2 样品对色谱柱的损害因素
杂质堵塞:样品中的微粒同样会使柱子堵塞,样品也应进行过滤处理。

样品组分的不可逆吸附:通常被吸附的组分有蛋白质、醣等,可以采取加装保护柱,或使用适应的溶剂反冲来处理。常用溶剂有四氢呋喃(适用于溶解有机高聚物和工业样品中的焦油)、高浓度的脲或盐酸胍溶液(使蛋白质改性而洗脱)、高离子强度的磷酸盐缓冲液(pH=7,适合反相柱和离子交换柱,可除去蛋白质和醣等)。

样品组分与固定相反应:这种反应对NH2柱的影响较严重,NH2易和酐、酮形成希夫(Schiff)缩合而减少活性点,使保留时间缩短,因此羰基化合物样品和流动相(如丙酮、乙酸乙酯等)不宜使用NH2柱。

活性点被覆盖:由于固定相吸附样品中的组成或杂质而使活性点被覆盖,在柱压升高的同时保留时间减少,将样品过滤或使用萃取分离柱(对大分子有机物如蛋白质、白细胞等)效果较好。

3、色谱柱固定相的化学变化
色谱柱固定相分解、活性基团变性以及键合相基团脱落会使保留时间显著变化。

3.1 键合相基团脱落
绝大多数键合相都是通过硅氧硅键(Si-O-Si)连接在硅基质上,形成带有机基团的固定相Si-O-Si-R(R为G18H37、C8H17、CnH2n+1)。硅氧硅键可在水溶液中水解而断裂,使键合相基团脱落,对C2和NH2柱键合相基团脱落不可忽视。为减少或防止基团脱落,可增加流动相的有机溶剂量,降低离子强度和pH值,对基团已脱落的固定相,可用合适的硅烷试剂再生。

3.2 固定相分解或活性基团变性
例如氰基柱的保留时间显著缩短,但键合相中C、H、N的百分含量并无大变化,证明未发生—CN水解成-COOH反应,而是形成了衍生物。在硅上增加烷基可减少水解。

4、高效液相色谱柱的保养
色谱柱在使用一段时间后,常遇到柱子受污染,柱效下降的问题,采用适当的方法对色谱加以保护和再生,能够延长色谱柱的使用寿命。

使用保护柱和过滤样品、流动相:流动相中若有不纯物聚积存柱顶,将影响柱寿命,所以溶剂应使用HPLC级的,样品和流动相用前先以微孔薄膜过滤。对于较昂贵的色谱柱,可以在柱前加一个保护柱,防止样品中杂质污染分析柱,对于制备柱,因其进样量大,使用保护柱尤为重要。

已污染柱的处理:因保留强的物质污染,柱顶或样品中不溶物沉积于柱顶,可用下列方法洗涤:(1)去除脂类可用四氢呋喃乙腈或甲醇洗涤;(2)去除蛋白质可用乙腈,丙醇和1%三氯乙酸进行梯度洗脱;(3)某些高疏水性化合物,可用乙腈或甲醇洗脱,同时反复注入四氢呋喃(100-200)ml。

对于使用一段时间后柱效下降的色谱柱可按下列方法进行再生。再生处理包括活化(右→左)和净化(左→右)两种。(1)硅胶、氧化铝和极性(正相)键合相色谱柱按下列顺序依次冲冼:三甲基戍烷或已烷→三氯乙烷→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水。(2)键合相硅胶柱:苯基、氰基键合相柱按以下顺序冲洗:蒸馏水→甲醇(冲洗过程中可加入少量二甲基甲酰胺)→分离样品用的流动相。(3)阴、阳离子交换柱:酸性有机物吸附在固定相表面的用低pH缓冲液冲洗,碱性有机物用高pH缓冲液冲洗,然后依次用蒸馏水→甲醇→二氯甲烷→甲醇→蒸馏水冲洗干净。

柱头处理:对于柱顶堵塞、严重污染,用溶剂冲洗无效的色谱柱,只有打开柱子去掉柱顶的填料重填:先拆下不锈钢烧结过滤器,检查柱床,常见塌陷或受污染的带色填料,剔掉无规则床层和带色填料,使柱床显白色并完全水平,再用甲醇作糊状填料匀浆液,将糊状填料匀浆液滴在柱上靠重力从匀浆液中排出甲醇液,重复直到填料水平。

柱子的贮存:柱子不能贮存于水或水性溶剂中,否则会引起细菌在柱中生长或产生盐类沉淀。贮存前应先用适当的溶剂(如甲醇),将柱子冲洗干净,再将柱子两头密封,以防溶剂蒸发使柱子干燥而引起柱子结构的几何学改变。

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