资料：分光光度计操作规程与光谱分析技术

化工小能手

2015/05/03

私聊

紫外可见分光光度计（UV）

一、仪器分析设备
　　721、723可见分光光度计、752紫外可见分光光度计、UV-2401PC紫外可见分光光度计、UV- 3150PC紫外可见近红外分光光度计、 RF-5301PC荧光分光光度计、比色液及标准溶液、滤纸等。
　　三、原　　理
　　光谱仪器是一种简单易用的分光光度法与红外光谱测定通用仪器，不同型号的机器测定的波长范围不同，可以根据自己的需要选择要使用的仪器。
　　不同型号的光谱仪器的构造有很大的差别，但是其基本原理是相同的。根据溶液中各种成分对透过光的吸光度不同，在一定范围内，吸光值(或者透过率)与溶质的浓度成正比(玻尔定律)。通过准确浓度的标准品对应其吸光值(透过率)作图，我们就可以得到一条标准曲线。测定未知浓度的待测样品的吸光值(透过率)，与标准曲线相比较就可以得到其浓度。
　　四、适用范围
　　可广泛用于医学卫生、临床检测、生物化学、石油化工、环保检测、质量控制等方面作定量、定性分析。
　　具体到我们实验室，可以对多糖、蛋白、核酸等物质进行定性、定量测量。同时UV-3150PC紫外可见近红外分光光度计还可以测量近红外光谱区的固体、液体样品的吸收光谱，RF-5301PC荧光分光光度计可以测定荧光物质的发光强度光谱，同时他们自带的软件可以方便的进行数据处理与分析。
　　五、操作步骤
　　我们以UV-3150PC紫外可见近红外分光光度计为例讲述光谱仪器的性能和操作方法。
　　1、插上电源，打开光度计前面的电源开关。
　　2、双击计算机桌面UVProbe图标，打开UVProbe软件，点击UVProbe中“Connect”图标联机，出现自检画面。
　　3、如自检完全部绿灯亮，则点击“OK”进入系统。若出现红灯亮，可关掉光度计重新连接，若仍未通过自检，应立即报告仪器负责老师。
　　4、完全通过并进入系统，出现UVProbe菜单栏和工具栏。UVProbe有四大主要模块，包括光谱扫描模块、光度测量模块、时间扫描模块和报告生成器。每种模式都可以直接点击后面的方法设定按钮设置方法。
　　5、点下光谱扫描图标，出现光谱扫描界面。
　　6、点击方法按钮，出现方法设置对话框。在此可以设置扫描波长范围，仪器的最大范围为3200～190nm。可以设置扫描速度，一般可选中速(Medium)或快速(Fast)进行扫描。采样间隔表示光度计每隔多少nm读一个吸光度值，如没有特殊要求，选择自动即可。可选择是否重复扫描曲线，若重复则设置重复次数和间隔时间。
　　7、点击“Sample Preparation”输入样品信息。包括样品的质量、体积、稀释倍数和测量光程等。也可以输入样品的其他信息。
　　8、点击“Instrument Parameters(仪器分析参数)”设置测量方式和仪器的一些参数。在测量模式中可选择“Transmittance(透过率)”、 “Absorbance(吸光度)”、“Energy(能量)”和“Reflectance(反射)”，其中Reflectance一般用积分球测定固体样品时使用。狭缝设置在3200～800nm下设为5nm，在800～190nm设为2nm。若包括这两个范围的波长如1500～500nm则选择狭缝为 5nm。
　　9、换灯和检测器可根据所测样品进行设置，换灯在393～282nm范围内任意值均可，换检测器在895～750nm 范围内任设一个值即可。但换灯和检测器由于仪器进行机械的移动，会造成信号波动较大，称仪器噪音大，此时所得扫描曲线误差较大，所以所设波长应该避免在样品吸收峰位置以免影响测定值。
　　10、所有参数设置完成后，两个样品架均不放置样品或两个均放上同样的空白溶液，点击“Baseline”，开始进行基线校正，仪器扫描完成后，点击“λGoToWL”将波长转到750nm，点击“Auto Zero”把750nm的波长设为0。点击“Start”再次扫描，若得出曲线最值均小于0.001，则认为基线平坦，若数值较大，则将750nm吸光度设为0重新进行基线扫描。
　　11、基线校正完成后，取出样品架的空白溶液，放入样品溶液，点击“Start”开始扫描曲线。扫描完成后，出现保存路径框和文件名框，设置好后出现扫描曲线。
　　12、曲线扫描完成后，在谱图上点击鼠标右键，出现快捷菜单。点击“AutoScale”可是软件自动调节图像坐标使之适合扫描所得数据。点击 “Cross Hair>Display”鼠标显示为交叉线，用鼠标将交叉线放到曲线上某点即可显示该点的波长和吸光度值。
　　13、点击“Label”可以在谱图上添加标签，可在其中输入文本以标记谱图。点击“Legend”出现各数据保存图，若在前面框里勾选该光谱数据，则在左面重叠图上显示其曲线。
　　14、若从右键快捷菜单中选择“Customize(自定义)”，可以自定义曲线显示颜色还可定义坐标轴的数值。
　　15、得出曲线后可以对谱图进行一系列的处理。
　　(1)点击“DataPrint(显示数据)”图标可以将谱图曲线直接显示为数值。
　　(2)点击“Manipulate(运算)”图标，可以进行加减乘除、差谱、扣除空白、倒数光谱、对数光谱等处理。
　　(3)点击“PeakPoint(显示峰值)”按钮显示“波峰”和“波谷”的数值。
　　(4)点击“PointPick”图标，输入要显示的波长值，立即显示出所输入波长处的吸光度值。
　　(5)点击“PeakArea”，设定峰阈值，即显示大于此阈值的峰区域。
　　(6)点击“Sewingbox(裁缝)”图标，可以进行谱图的裁剪和缝合。
　　16、曲线扫描完成后数据实际直接保存在内存中，并没有保存到硬盘上，此时若关闭窗口，电脑会提示“Some Spectrum data has not been saved!Do you still want to exit and lostunsaved change?(还有光谱数据尚未保存，你是要离开而不保存数据吗?)”选择“No”返回主界面保存所有数据。
两篇相关资料，感觉不错：《分光光度计标准操作规程(SOP)》《紫外/可见分光光度计系统的使用方法》
　　六、注意事项
　　1、光度计灯源寿命有限，若长时间不测量，应通过UVProbe软件断开连接(点击“Disconnect”)，然后关闭光度计电源。
　　2、使用分光光度计时要保证样品室绝对干净，小心放入样品，放入比色皿前一定要先用滤纸和擦镜纸将比色皿外表面擦干净，不要污染样品池和光度计外表面。
　　3、仪器自检和扫描的过程中，不要打开样品室盖。
　　4、软件不会自动保存数据，所有的数据要保存都必须点击“Save”或者“SaveAs”进行另存。否则数据会丢失。
　　5、认真填写贵重仪器使用记录。
　　七、思考题
　　1.干扰测定结果的因素有哪些?
　　2.为了更好的维护和保养仪器，我们在使用的过程中应该注意哪些方面?

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