测定食品中盐酸克伦特罗（瘦肉精）含量的案例

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2015/08/04

私聊

食品添加剂

一、案例
盐酸克伦特罗，人称“瘦肉精”。既不是兽药，也不是饲料添加剂，而是肾上腺类受体激动剂(神经兴奋剂)。虽然并没有被批准作为合法的动物生长调节剂，但一些年来，由于人们知道在畜牧生产中，能改进脂肪型动物的肉与脂肪的比例或加速动物生长，因此，为谋取暴利，国内一些饲料加工企业、饲料添加剂企业及养猪饲养业主，为使商品猪多长瘦肉少长脂肪，在饲料中任意滥施“瘦肉精”。人食用了“瘦肉精”的猪肉和内脏，“瘦肉精”摄入量超过20mg就会出现中毒症状，产生心悸、心慌，严重时产生恶心、呕吐以及肌肉颤抖。
二、选用的国家标准
GB／T 5009．192—2003动物性食品中克伦特罗残留量的测定一高效液相色谱法。
三、测定方法
1．提取
(1)肌肉、肝脏、肾脏试样称取肌肉、肝脏或肾脏试样lOg(精确0.Olg)，用20mL0.1mol／L高氯酸溶液匀浆，置于磨口玻璃离心管中；然后置于超声波清洗器中超声20min，取出置于80℃水浴中加热30min，取出冷却后4500r／min离心15min。倾出上清液，沉淀用5mL 0.1mol／L高氯酸溶液洗涤，再离心，将两次的上清液合并。用1mol／L氢氧化钠溶液调pH值至9.5，若有沉淀产生，再以4500r／min离心10min，将上清液转移至磨口玻璃离心管中，加入8g氯化钠，混匀，加入25ml。异丙醇+乙酸乙酯(40+60)，置于振荡器上振荡提取20min。提取完毕，放置5min(若有乳化层稍离心一下)。用吸管小心地将上层有机相移至旋转蒸发瓶中，用20mL异丙醇+乙酸乙酯(40+60)再重复萃取一次，合并有机相，于60℃在旋转蒸发器上浓缩至近干。用1mL O.1mol／L磷酸二氢钠缓冲液(pH一6.0)充分溶解残留物，经针筒式微孔过滤膜过滤，洗涤三次后完全转移至5ml。玻璃离心管中，用0.1mol／L磷酸二氢钠缓冲液(pH=6.O)定容至刻度。
(2)尿液试样用移液管量取尿液5mL，加入20ml。0.1mol／L高氯酸溶液，超声20min混匀。置于80℃水浴中加热30min。以下按(1)从“用1mol／L氢氧化钠溶液调pH
值至9.5……”起开始操作。
(3)血液试样将血液于4500r／min离心，用移液管量取上层血清1mL，置于5ml。玻璃离心管中，加入2mL O.1mol／L高氯酸溶液，混匀，置于超声波清洗器中超声20min，取出置于80℃水浴中加热30min。取出冷却后以4500r／min离心15min。倾出上清液，沉淀用1mL O.1mol／L高氯酸溶液洗涤，4500r／min离心10min，合并上清液，再重复一遍洗涤步骤，合并上清液。向上清液中加入约1g氯化钠，加入2mL异丙醇+乙酸乙酯(40+60)，在涡旋式混合器上振荡萃取5min，放置5min(若有乳化层稍离心一下)，小心移出有机相于5ml。玻璃离心管中，按以上萃取步骤重复萃取两次，合并有机相。将有机相在N2-浓缩器上吹干。用1ml 0.1mol／L磷酸二氢钠缓冲液(pH一6.0)充分溶解残留物，经筒式微孔过滤膜过滤完全转移至5mL玻璃离心管中，并用0.1mol／L磷酸二氢钠缓冲液(pH：6.0)定容至刻度。
2．净化
依次用10ml乙醇、3mL水、3mL 0.1mol／l。磷酸二氢钠缓冲液(pH一6.O)、3mL水冲洗弱阳离子交换柱，取适量上述提取液至弱阳离子交换柱上，弃去流出液，分别用4mL水和4mL乙醇冲洗柱子，弃去流出液，用6ml。乙醇+浓氨水(98+2)冲洗柱子，收集流出液。将流出液在N2-蒸发器上浓缩至干。
3．试样测定前的准备
于净化、吹干的试样残渣中加入100～500μL流动相，在涡旋式混合器上充分振摇，使残渣溶解，液体混浊时用O.45μm的针筒式微孔过滤膜过滤，上清液待进行液相色谱测定。
4．测定
(1)液相色谱测定参考条件
①色谱柱：BDS或ODs柱，9,50mm×4.6mm，5μm。
②流动相：甲醇+水(45+55)。
③流速：1mL／min。
④进样量：20～50μL。
⑤柱箱温度：25℃。
⑥紫外检测器：244nm。
(2)测定吸取20～50μL标准校正溶液及试样液注入液相色谱仪，以保留时间定性，用外标法单点或多点校准法定量。
5．结果计算
X=A*f/m
式中X一——试样中克伦特罗的含量，μg／kg或μg／L；
A——试样色谱峰与标准色谱峰的峰面积比值对应的克伦特罗的质量，ng；
f——试样稀释倍数；
m——试样的取样量，g或mL。
6．试剂
①氯化钠。
②高氯酸溶液(0.1mol／L)。
③氢氧化钠溶液(1mol／L)。
④磷酸二氢钠缓冲液(0.1mol／L，pH一6.0)。
⑤异丙醇+乙酸乙酯(40+60)。
⑥乙醇+浓氨水(98+2)。
⑦甲醇+水(45+55)。
⑧克伦特罗标准溶液的配制：准确称取克伦特罗标准品，用甲醇配成浓度为250mg／L的标准储备液，储于冰箱中；使用时用甲醇稀释成0.5mg／L的克伦特罗标准使用液，进一步用甲醇+水(45+55)适当稀释。
7．仪器
①水浴超声清洗器。
②磨口玻璃离心管：11.5cm(长)×3.5cm(内径)，具塞。
③5mL玻璃离心管。
④酸度计。
⑤离心机。
⑥振荡器。
⑦旋转蒸发器。
⑧涡旋式混合器。
⑨针筒式微孔过滤膜(0.45μm，水相)。
⑩N2-蒸发器。
⑩匀浆器。
⑩高效液相色谱仪。
⑩弱阳离子交换柱(LC—WCX)(3ml)。

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