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气质联用-内标法测定豆类中脂肪酸含量及因子分析

wakinqian

2015/08/17

私聊

食品安全/营养与健康

摘要
对市售九种豆类（鹰嘴豆、黄豆、青豆、花芸豆、扁豆、豌豆、绿豆、黑豆、红豆）中的脂肪酸化合物成分进行含量测定研究。通过氢氧化钾-甲醇溶液的酯化反应，以正己烷为溶剂，以十一烷酸甲酯为内标物进行含量计算，采用气相色谱-质谱联用技术对样品中脂肪酸甲酯成分进行分离并辅助NIST检索工具分析成分。通过本次试验建立内标法计算各种豆类中脂肪酸组分含量的方法。结果表明，本次试验的九种豆类样品的脂肪酸组分及含量均有差异，其中青豆的总脂肪含量最高，鹰嘴豆的不饱和脂肪酸含量最高。通过主成分分析获得前2个主成分可以解释全部变异的98%。通过聚类分析将九种豆类归入四大类。该实验方法简便快捷，可为同类产品脂肪酸含量研究提供借鉴。

关键词：豆类；脂肪酸；气质联用；内标法；因子分析；聚类分析
中图分类号：文献标识码：A 文章编号：

Determination of fatty acids and factor analysis from beans by gas chromatography mass spectrometry using internal standard Method

Abstract: Study on fatty acid composition in nine kinds of beans samples including chickpea、soybean 、 green pea colored kidney bean、dolichos lablab、pea、mung bean、Black bean、Red Bean. Through esterification reaction, using hexane as solvent and quantified by internal standard C11:0 methyl ester. The technology of gas separation of fatty acid methyl ester composition andcomposition analysis of NIST helper tools to retrieve chromatography-mass spectrometry. The results showed, Both fatty acid components and contents are difference between nine kinds of beans samples of this experiment, It can be seen that green beans had the highest total fat content in those samples, chickpeas had the highest content of unsaturated fatty acids. The first principal components obtained by factor analysis could account for 98% of all variations. The single linkage dendrograms based on principal component values divided the nine kinds of beans into four clusters. This test method is simple and fast, which can provide reference for the similar products of fatty acid content.
Key words: beans; fatty acids; gc-MS; internal standard method; factor analysis; cluster analysis

当今社会人们对膳食结构的研究日益关注，对食品的要求也从生理需要向营养、食用健康等方面关注，豆类的品种很多，泛指所有能产生豆荚的豆科植物，是中国人的传统食品。各种豆类均含有人体必须的营养成分，有很高的食用和保健价值，可以提高人体的抵抗能力，能有效降低心脏病和癌症的发病几率，目前根据豆类的营养素种类可将它们分为两大类。一类为高蛋白质、高脂肪豆类。另一种豆类则以碳水化合物含量高为特征，本次试验选择九种常见膳食豆类进行脂肪酸含量测定研究，较为系统的对多种豆类进行脂肪酸含量的比较，通过主成分分析和系统聚类分析进行研究，本次测定方法简便快捷，色谱分离完全，专属性好，通过本研究可为豆类样品的脂肪酸含量检测提供可靠的试验依据。
1材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 试验对象
豆类：鹰嘴豆、黄豆、青豆、花芸豆、扁豆、豌豆、绿豆、黑豆、红豆，市售。
1.1.2 主要试剂
标准品：脂肪酸甲酯混合标准品（纯度≥99%）；内标物：十一烷酸甘油三酯（5.00mg/mL)。
正己烷、甲醇，由Fisher Scientific公司生产，为色谱纯；氢氧化钾，由天津盛奥化学试剂厂生产，为分析纯。
1.1.3 主要仪器
气相色谱—质谱联用仪、配电子轰击离子源，由Perkin Elmer公司生产；分析天平，由OHAUS公司生产；旋涡混合器，由IKA公司生产。
1.2 实验方法
1.2.1 脂肪酸甲酯化
准确称取不同豆类样品的均匀粉末2.5g 于试管中，加入内标溶液2mL，加入5.0 mL氢氧化钾-甲醇溶液（2 mol/L），40 ℃水浴20 min进行脂肪酸甲酯化，冷却至室温后分别加入5.0mL正己烷进行脂肪酸甲酯萃取，每个样品分别漩涡30s后静置分层后，取上层有机相（正己烷）稀释后用微孔滤膜(0.45μm）过滤后装进样瓶进行气相色谱—质谱仪器分析。
1.2.2 气相色谱-质谱联用仪条件
色谱柱：FFAP（30 m×0.25 mm×0.5 μm）；载气：氦气（99.999%）；流速：1.0 mL/min；进样：1.0 μL，分流比1:10；进样口温度：250 ℃；程序升温：初始温度80 ℃，以10 ℃/min升温至230 ℃，保持15 min；离子化方式：电子轰击（EI）；离子化能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；传输线温度270 ℃；溶剂延迟：2 min；扫描范围：50～450 amu；扫描方式：全离子扫描（SCAN）。
1.2.3 豆类样品中脂肪酸组分定性分析
对37种脂肪酸标准进行全离子扫描分析，辅助NIST2011谱图库检索进行脂肪酸甲酯化合物质谱解析并确定各种脂肪酸甲酯的保留时间。通过保留时间及谱图检索匹配各种豆类脂肪酸的化学结构。
1.2.4 豆类样品中脂肪酸组分定量分析
对测试样品的色谱图进行解析，通过以下内标法公式进行计算：

；

1.2.5 统计分析方法
本次试验样品均称取3份，每个样品平行测定2次，取平均值进行数据分析，涉及相关统计分析、聚类分析和方差分析方法采用SPSS 22.0软件。
2 结果与分析
2.1 样品前处理方法的确定
目前脂肪酸的测定试验均需要进行样品的甲酯化反应，常规的甲酯化方法有三氟化硼法、三甲基氢氧化硫法（TMSH）法、重氮甲烷、盐酸-甲醇、硫酸-甲醇和氢氧化铵-甲醇等，以上方法均有一定的局限性。本文采用氢氧化钾-甲醇法进行甲酯化反应，通过多次试验均证明效果较好，该方法操作过程无危害、简单快速、重现性好。
2.2 脂肪酸甲酯标准品色谱分析
将脂肪酸甲酯混合标准液进样，通过优化最佳的色谱条件进行分析，由气-质联用仪工作站所得的色谱图见图1，各脂肪酸甲酯组分的保留时间及响应因子Fi值见表1。由标准色谱图可见各组分分离情况良好，内标物与其他组分也相互没有干扰，已达到定性与定量测定分析的要求。

图1 脂肪酸甲酯混合标准总离子流色谱图

Fig.1 Fatty acid methyl ester standard of total ion chromatogram

表1 脂肪酸甲酯保留时间及响应因子

Table 1 Fatty acid methyl ester retention time and response factor

序号	保留时间	化学成分（脂肪酸甲酯）	响应因子Fi
1	2.95	C6:0已酸甲酯	1.42
2	4.08	C8:0辛酸甲酯	1.17
3	6.14	C10:0葵酸甲酯	1.04
4	7.24	C11:0十一烷酸甲酯	1.00
5	8.33	C12:0十二烷酸甲酯	0.96
6	9.41	C13:0十三烷酸甲酯	0.95
7	10.45	C14:0肉豆蔻酸甲酯	0.86
8	10.84	C14:1肉豆蔻烯酸甲酯	0.98
9	11.46	C15:0十五烷酸甲酯	0.84
10	11.83	C15:1十五烷烯酸甲酯	1.05
11	12.43	C16:0棕榈酸甲酯	0.39
12	12.68	C16:1棕榈油酸甲酯	0.92
13	13.36	C17:0十七烷酸甲酯	0.81
14	13.61	C17:1十七烷烯酸甲酯	0.97
15	14.26	C18:0硬脂酸甲酯	0.80
16	14.46	C18:1(Z)油酸甲酯	0.82
17	14.87	C18:2(Z,Z)亚油酸甲酯	0.80
18	15.13	C18:3亚麻酸甲酯	0.99
19	15.43	C18:3亚麻酸甲酯	0.94
20	16.05	C20:0花生酸甲酯	0.84
21	16.28	C20:1花生一烯酸甲酯	0.94
22	16.82	C20:2花生二烯酸甲酯	0.93
23	17.17	C20:3花生三烯酸甲酯	0.88
24	17.47	C20:4花生四烯酸甲酯	1.16
25	17.65	C21:1二十一烷酸甲酯	1.12
26	18.41	C20:5 EPA	1.23
27	18.53	C22:0山嵛酸甲酯	0.91
28	18.88	C22:1芥酸甲酯	1.08
29	19.75	C22:2二十二烷二烯酸甲酯	1.09
30	20.25	C23:0二十三烷酸甲酯	0.99
31	22.44	C24:0木蜡酸甲酯	1.05
32	23.05	C24:1神经酸甲酯	0.71

2.3 豆类样品中脂肪酸成分分析
根据仪器分析测定，确定各种豆类样品中脂肪酸甲酯组分的结果。由气相色谱-质谱仪器的工作软件得到的各种豆类样品总离子流图见图2。

图2 各种豆类的脂肪酸甲酯总离子流色谱图(a~i: 鹰嘴豆、黄豆、青豆、花芸豆、扁豆、豌豆、黑豆、红豆、绿豆)

Fig.2 Fatty acid methyl ester total ion chromatograms of all kinds of beans

2.4 色谱仪器重现性试验
取同一样品重复测定3次，按试验步骤进行分析，其中各脂肪酸含量变异系数（CV）值均低于3%，表明本次试验的仪器稳定性较好，测定数据符合要求。
2.5 方法精密度试验
平行称取5个鹰嘴豆样品按方法进行脂肪酸甲酯化试验，同时测定其含量并计算相对标准偏差（RSD），该值均低于8%，表明该方法精密度较高，符合试验测定的要求。
2.6 豆类样品中脂肪酸含量测定结果
本次试验测定的九种豆类品种中均含有约10种脂肪酸成分，脂肪酸组分有近似也有差异，由内标法公式计算所得各种脂肪酸甲酯含量，以及按国家标准脂肪酸甲酯转换系数的计算结果和脂肪酸相关参数对比见表2。可见不同豆类样品的含量有较大的差别，每种样品的总脂肪含量比较见图3，脂肪酸种类图比较见图4，其中青豆的总脂肪含量最高，红豆最低；鹰嘴豆的不饱和脂肪酸含量在本次测试样品中含量最高。
在脂肪酸与人类疾病相关研究中，饱和脂肪是导致心血管疾病高发的膳食品种，此次试验结果在相关参数统计中引入动脉粥硬化指数(Atherogenicity Index)比率仅供参考。不饱和脂肪酸对人体血脂和心血管疾病的影响已得到广泛的研究，富含不饱和脂肪酸的食品可有效降低血脂、预防心血管疾病的功效，被推荐给该疾病的高危人群食用。

表2 豆类样品脂肪酸相关参数（n=3）

Table 2 The fatty acid related parameters of Beans samples (n=3)

序号	保留时间	化学成分	平均测定含量（mg/100g）
			鹰嘴豆	黄豆		青豆		花芸豆		扁豆		豌豆		绿豆		黑豆		红豆
1	10.45	C14:0	4.74	5.33		6.56		0.16		0.65		0.76		0.67		3.61		0.00
2	11.46	C15:0	2.15	—		—		—		0.33		0.44		—		—		0.00
3	12.43	C16:0	325.6	886.9		942.0		174.6		145.5		121.0		228.3		579.8		118.26
4	13.36	C17:0	1.27	8.60		8.62		1.31		0.49		0.89		0.86		4.29		0.52
5	14.26	C18:0	71.9	790.1		850.6		30.9		46.1		51.2		87.01		532.0		19.14
6	14.46	C18:1(Z)	1349.1	2890.8		3539.1		169.2		367.4		534.3		190.59		2540.2		25.58
7	14.87	C18:2(Z,Z)	2735.2	7361.3		7792.8		515.2		820.6		776.5		840.18		5210.7		395.89
8	15.43	C18:3	197.6	1618.6		1813.4		825.8		236.8		140.0		274.53		830.24		143.19
9	16.05	C20:0	21.3	46.5		46.7		2.24		5.90		2.60		9.48		29.91		1.25
10	16.28	C20:1	7.84	8.48		8.01		0.11		0.75		0.36		0.00		5.66		0.00
11	18.53	C22:0	9.95	44.75		50.52		4.22		3.30		—		11.45		31.30		6.75
相关参数
SFA			414.9	1694.4	1811.2		202.6		192.1		168.0		320.9		1122.8		145.9
MUFA			1292.8	2762.2	3379.4		161.3		350.7		509.4		181.6		2425.5		25.6
PUFA			2793.0	8556.6	9153.8		1280.6		1007.8		873.2		1062.5		5755.0		539.1
总脂肪含量（TG）			4705.0	13599.4	14990.1		1716.2		1620.4		1620.6		1635.6		9723.3		742.7
AI（比率）			0.08	0.08	0.07		0.12		0.10		0.09		0.18		0.07		0.21
PS（比率）			6.73	5.05	5.05		6.32		5.25		5.20		3.31		5.13		3.69

注：”—”表示含量很低或未检出；SFA为饱和脂肪酸；MUFA为单不饱和脂肪酸；PUFA为多不饱和脂肪酸；AI=/Σ(MUFA+PUFA)为动脉粥硬化指数；PS=PUFA/SFA。

图3 豆类样品总脂肪含量比较

Fig.3 Comparison of the total fat content of beans samples

图4 不同脂肪酸种类比较

Fig.4 Comparison of different kinds of fatty acids

2.7 测定脂肪酸组成指标间的相关性分析
本次试验测定的11项脂肪酸组成指标间经过软件分析相关性结果见表3，其中组分间除十五烷酸外，都具有很好的显著相关性，为分析提供很好的数据支持。

表3 相关系数矩阵

Table 3 Correlation matrix

组分	肉豆蔻酸	十五烷酸	棕榈酸	十七烷酸	硬脂酸	油酸	亚油酸	亚麻酸	花生酸	花生一烯酸
十五烷酸	0.239
棕榈酸	0.906**	-0.183
十七烷酸	0.845**	-0.284	0.985**
硬脂酸	0.843**	-0.312	0.986**	0.986**
油酸	0.939**	-0.067	0.969**	0.937**	0.959**
亚油酸	0.929**	-0.122	0.992**	0.970**	0.980**	0.989**
亚麻酸	0.741*	-0.384	0.924**	0.956**	0.925**	0.850**	0.887**
花生酸	0.949**	-0.047	0.987**	0.951**	0.957**	0.973**	0.991**	0.860**
花生一烯酸	0.979**	0.324	0.860**	0.792*	0.787*	0.899**	0.893**	0.676*	0.920**
山嵛酸	0.859**	-0.280	0.989**	0.973**	0.988**	0.949**	0.976**	0.914**	0.965**	0.804**

*表示显著相关（P<0.05)；**表示极显著相关（P<0.01)。
2.8 豆类样品主成分分析
2.8.1 相关系数矩阵特征值和累积贡献率分析
主成分分析可以将具有复杂关系的变量，通过降维而反映出相应的内在联系，从而选择少数具有主导作用的独立变量。本次试验数据通过软件处理得到的结果见表4，根据累积贡献率达到85%以上，信息损失量在15%以下的原则，通过分析可以得出以下结论：在选择前2个主成分分别解释总变异的84.6%和13.6%，则累积贡献率就可以达到98.2%，因此可以将前2个定义为第1主成分和第2主成分。

表4 相关系数矩阵特征值和累积贡献率

Table 4 The character value and accumulative contribution rate of correlatede matrix

主成分	特征值	总变异比例(%)	累积贡献率(%)
1	9.307	84.607	84.607
2	1.491	13.557	98.163

2.8.2 主成分的特征向量
通过软件进行主成分分析可以得到主成分特征向量值和因子载荷图，分别见表5和图5，从数据结果可以看出第1主成分包括肉豆蔻酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生酸、花生一烯酸、山嵛酸；第2主成分包括十五烷酸。

表5 主成分的特征向量

Table 5 Character vector of principal components

序号	组分	第1主成分	第2主成分
1	肉豆蔻酸	0.927	0.367
2	十五烷酸	-0.134	0.987
3	棕榈酸	0.997	-0.051
4	十七烷酸	0.978	-0.163
5	硬脂酸	0.981	-0.178
6	油酸	0.982	0.075
7	亚油酸	0.997	0.018
8	亚麻酸	0.911	-0.290
9	花生酸	0.990	0.091
10	花生一烯酸	0.886	0.452
11	山嵛酸	0.981	-0.144

图5 主成分因子载荷图

Fig.5 Principal component factor loading graph

2.9 豆类样品聚类分析探讨
豆类样品的品种不同，其脂肪酸组成和含量也有一定的差异，对此以脂肪酸含量作为变量对试验对象进行聚类分析探讨，基于软件得出的聚类图（图6）将本次试验豆类样品分为四大类，其中黄豆和青豆一类；花芸豆、扁豆、豌豆、绿豆和红豆归为一大类；鹰嘴豆和黑豆各成为独立类。

图6 九种豆类样品的单联树状聚类图

Fig 6 Dendrogram using single linkage of nine beans samples

3 结论

天然食物均含有各种不同的脂肪酸成分，脂肪酸有着重要的生理功能，是人类所需的营养之一，脂肪酸的种类很多，不同脂肪酸对人体的作用各不相同，单独讨论某种或某类脂肪酸的好坏是不科学的，脂肪酸不同比例的合理摄入在一定程度上关系着人体的健康，因此研究不同食品中脂肪酸组分具有很高的营养学价值，同时对各种样品中的脂肪酸含量的准确测定也是趋势。
目前在食品中功能性营养成分的开发与研究中，脂肪酸作为研究的重点一直得到人们的广泛关注，尤其注重在脂肪酸组分的相似与差异方面，应用主成分分析是试验研究的主要内容。本文建立了气质联用-内标法准确测定不同豆类中脂肪酸的含量，通过试验证明该方法具有较高的甲酯化反应效率，试验过程简单，测定结果重复性较好；样品中的脂肪酸组分在较短时间内通过色谱柱完全分离，适合作为准确测定豆类产品中脂肪酸含量的快速简便方法。
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