安捷伦DAD检测器提取色谱图检测峰纯度

一片枫叶

2015/12/03

私聊

液相色谱（LC）

光谱功能——如何优化色谱条件，提取色谱图

实现这些功能的前提条件是已经购买了DAD检测器及光谱分析软件，并且在“仪器配置”窗口“选项”相下选择”3D”光谱评估”，工作站的”数据分析”界面中会出一个”光谱”菜单，如上图所示：

扣除背景吸收后的紫外吸收光谱图更接近于化合物本身的吸收光谱，扣除背景吸收的方式可以是自动扣除，也可以是手动选择参考扣除。

在快捷视图模式下，可以通过下方窗口快捷查看使用不同检测波长获得的不同色谱图，也可以在窗口上方看到各个时刻所采集到的不同光谱图。
如果要提取所需条件下的色谱图，需要先将”游标”选项的下拉菜单改为”信号”，然后选择适当的样品检测波长，谱带宽度(可以按住Ctrl键的同时拖动鼠标左键），参考波长，谱带宽度，此时即可得到所需检测条件的色谱图，单击窗口左下角”复制”键，化学工作站会自动将所需的色谱图转入到数据分析界面，以便进行进一步的数据分析。
光谱功能——峰纯度检测

要进行峰纯度检测，选择”光谱”菜单下”选择峰纯度”，或选中峰纯度检测快捷键后，在色谱图上单击要进行检测的色谱峰即可对该色谱峰进行峰纯度判断。

在光谱选项的“峰控制光谱数据文件”项下的“阈值”用来定义谱图匹配的限制，高于此限制的色谱峰则很可能是纯峰，限制范围为：0~1000
计算阈值：基于每个峰的信噪比，工作站自动计算每个峰的峰纯度阈值(只适用于数据文件中用”全部”或“峰的全部”保存的样品)。
固定阈值：用户自己设定阈值限制，不受峰的信噪比的影响，为固定值。

在峰纯度分析窗口可以从多个角度判断色谱峰是否纯净，其中光谱重叠好坏程度是一个很重要的判断依据。
可以从窗口下方的提示行看到检测结果，点击峰纯度信息图标可以进一步了解峰纯度的信息。
注意：紫外吸收光谱毕竟不是定性的好手段，我们可以通过吸收光谱判断某色谱峰不纯，但不可以判断该色谱峰一定纯净，利用DAD进行峰纯度检测的结果仅仅是一个参考信息而已。

光谱相似性曲线：给出峰纯度的详细信息，理想的绝对纯的色谱峰的光谱相似性曲线为在1000处一平坦的直线（见下图左侧图）

由于在峰的起点终点位置信噪比下降，背景噪音对峰图谱的影响非常明显，致使光谱相似性曲线变成右侧图形状。
阈值曲线：显示给定相似曲线的噪音效果，实际上阈值曲线是一条受到背景噪音影响的相似曲线。

要使用峰纯度检测功能一定要注意本页所给出的条件优化方法，
阈值的设定合理与否也会影响所得纯度检测结果，可以在“光谱选项”中“纯度”栏内规定使用化学工作站自动计算的阈值还是使用自行规定的阈值。
关于峰纯度的定义检测及讨论

1.关于峰纯度的原理：
工作站依据光谱匹配度来衡量峰纯度，光谱可以用来表征化合物分子结构特征，在进行峰纯度检测时，工作站会将被检测峰上采集的所有光谱做归一化处理，然后比较光谱的匹配性。如果一个色谱峰中只含有一种组分(峰纯度很好)，峰上各个时间点采集到的光谱的外形几乎是一致的，做归一化处理后所有的光谱几乎一样的，如果所有的光谱一模一样，则匹配因子将达到1000(100%匹配)；如果一个色谱峰含有多种组分，只要组分间的光谱有差异，当将峰上每个采集时刻的光谱做归一化处理之后匹配度自然很差。峰纯度的阈值相当于一个衡量标准，能影响到峰纯度检测直接给出的结果，我们可以选择由工作站来计算阈值(工作站根据被检测峰的信噪比计算，因此每个峰给出的阈值会略有不同)，也可以自行设定固定阈值，推荐值是990(相当于99%相似)。
2.利用光谱进行纯度检测的局限性：

a.当我们用普通的C18柱(而非手性柱)分析手性样品时，纯度检测就无能为力了，手性组分中不同消旋体之间的光谱是一致的；

b.如果混合物中组分间的光谱类似，而各组分在色谱柱上的扩散程度也几乎一致(完全没有分开)，各个时间点采集到的混合光谱几乎是一致的，也会得到很高的纯度匹配因子；

c.另外当被检测峰的浓度很高时，会导致尤其是峰顶点处的光谱由于浓度高而变形，即便是纯的组分也很可能得到很低的纯度因子；

d.如果采集的光谱较少，则纯度检测的结果基本上是不可靠的，假设峰上只采集了一张光谱，即便是混合物，纯度因子却能达到1000。

总结看来，峰纯度功能可以给出否定的答案(色谱峰是混合物)，很难给出肯定的答案(色谱峰是纯的)，只能说可能是纯的，此时峰纯度信息仅作为参考信息！
3.峰纯度检测的步骤
a.设置纯度检测阈值：点击Spectra(光谱)菜单下的Spectra Options(光谱选项)，在光谱选项窗口点击Purity(纯度)，或选择Calculate Threshold(计算阈值)，或选择Fixed Threshold(固定阈值)，建议选择计算阈值，如果纯度检测结果显示的计算阈值过小再考虑设置固定阈值，推荐的固定阈值是990。

b.调用数据文件。注意，如果要使用峰纯度检测功能，采集数据之前一定要在DAD参数设置窗口选择保存全部光谱(英文工作站选择All)。
c.将光标切换到峰纯度检测状态：点击Spectra(光谱)菜单下的Select Peak Purity(选择峰纯度)，光标即变为峰纯度检测状态，点击要检测的色谱峰即可得到结果。

d.峰纯度的结果：
在右下方的窗口中可以看到色谱峰、阈值曲线和相似度曲线，相似度曲线对应的点低于阈值曲线即表明没有超出阈值

可以点击峰纯度信息快捷键(如下图)，查看当前的Purity factor(峰纯度因子)和Threshold(阈值)。

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【第六届原创】二极管阵列检测器与峰纯度分析链接：http://bbs.instrument.com.cn/topic/4302951

精
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私聊

浪淘沙隐

第1楼2015/12/03

非常好的文章，感谢楼主。另外吐槽下岛津的光谱系统。

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私聊

一片枫叶

第2楼2015/12/03

应助达人

使用岛津LC-Solution，DAD检测器，分析峰的纯度：（分享）
以下是对照品图3d图和在210nm下的吸收峰

以下是样品3d图和210nm下吸收图

背面

等高线

在再分析窗口下，点方法——选择DAD参数——选择纯度——选择你要计算的数据（提供的上述图片，未发现此窗口？）——选在基线噪声的时间段——纯度计算的波长范围和方式选择——然后确定就可以了。