农产品中氨基甲酸酯类农药检测的液相色谱条件优化研究

violet978

2016/08/08

私聊

液相色谱（LC）

农产品中氨基甲酸酯类农药检测的液相色谱条件优化研究

曾艳

摘要：本文在行业标准《NY/761-2008蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》用高效液相色谱法测定农产品中氨基甲酸酯类农药的基础上对色谱条件进行了优化研究。通过更换流动相及比例，建立了更高效的检测10种氨基甲酸酯类农药条件。研究表明，优化色谱条件后，色谱图的基线更平稳，组分保留时间平均缩短3.54min；在0.05-0.5mg/L范围内线性良好，相关系数为1.0（除涕灭威亚砜为0.9975外），检出限为0.001-0.007 mg/Kg；组分响应大大提高，峰高是之前的1.65-4.14倍，峰面积是1.62-3.97倍，连续7次进样的保留时间、峰高、峰面积相对标准偏差比优化前均有降低。优化的检测方法，快速简便，灵敏度高，准确可靠，有效的提高了工作效率，能满足农产品中氨基甲酸酯类农药的液相检测要求。
关键词：甲醇，乙腈，高效液相色谱，氨基甲酸酯类农药

Optimization of the method of HPLC todeterminated Carbamate pesticide in agricultural products residues

ZENG Yan

Abstract:This research was based onthe《NY/T 761-2008》byHPLC method to determination of carbamate pesticides in agriculturalproducts. This study was developed for the optimized chromatographic conditionsby changing the mobile phases and proportions, established a more efficientdetection of 10 kinds of carbamate pesticides. Study shows that the optimizedchromatographic conditions, the chromatograms baseline more smoothly, componentaverage save the retention times of 3.54 mins. The proposed methods showed agood linearity in the range of 0.05~0.5mg/Kg, with the linear correlationcoefficients of 1.0 (except aldicarb sulfoxid0.9975 ) and limits of detection of 0.001-0.007 mg/Kg . Components of responses are greatlyincreased: the peak heights are 1.65-4.14 times that of before and the peakareas are 1.62-3.97 times, 7 consecutive samples of retention times, peakheights and peak areas RSDs were lower than before optimization. The method is rapid, high sensitivity,accurate, reliable and effective and can be used for determination carbamate pesticidesin agricultural products.

Keywords: Alcohol, Acetonitrile,HPLC, Carbamate pesticide,
相对于有机磷杀虫剂, 氨基甲酸酯类农药以其残效小、选择性强、对人畜毒性较低等特点而被国内外广泛应用于病虫害的防治, 但不合理的使用仍对生态环境和农产品产生了一定的影响，随着国家对食品安全的重视不断提升，以及《农产品质量安全法》的颁布，果蔬中的氨基甲酸酯类农药残留检测至关重要。目前，资料报道的蔬菜、水果中氨基甲酸酯类农药残留检测方法主要有气相色谱法（GC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）、高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱-质谱法（[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp]LC-MS）等。现行行业标准《NY/T761-2008蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》即是用的高效液相色谱法（HPLC）。
利用高效液相色谱检测果蔬、食用菌等农产品样本的原则是要尽可能在较短的时间内使混合物完全的分离和定量。对于多农残的痕量分析还要求有较高的灵敏度，因此最佳的色谱条件对于待测组分进行定性和定量分析尤为必要。本试验采用高效液相色谱仪对蔬菜中10种氨基甲酸酯类进行检测，通过对色谱条件进行优化研究，对检测结果进行比较，得到了比前报道和行业标准更为准确高效、灵敏度更高的检测方法，提高了农产品中氨基甲酸酯类农药的检测效率。
1 材料和方法
1.1供试材料
乙腈、甲醇为色谱级（美国天地公司），柱后衍生试剂为pickering公司提供（包含邻苯二甲醛，OPA，巯基乙醇、OPA稀释剂和氢氧化钠溶液），水为超纯水，10种农药标准品（涕灭威亚砜、涕灭威砜、灭多威、三羟基克百威、涕灭威、速灭威、克百威、甲萘威、异丙威、仲丁威）购自农业部环境保护科研监测所（100μg/mL），纯度均大于99%，以乙腈稀释成合适浓度。供试样本为包含蔬菜、水果等农产品为试验样本，具体有菜豆，茄子，莴苣，黄瓜，结球甘蓝，油桃，马铃薯，黄果柑，随机选择。
1.2 仪器
Agilent 1260高效液相色谱仪（四元泵），配荧光检测器（FLD），柱后衍生系统为美国科学系统公司的斯威特柱后衍生系统双通道 PCR-2型，色谱柱为美国科学系统公司的Alltima C₁₈5μm4.6×250mm 色谱柱。
1.3 实验方法
1.3.1 标准液的配制
将以上10种氨基甲酸酯类农药配制成0.005、0.05、0.1、0.2、0.5μg /mL5个浓度梯度的混合标准溶液，为了消除基质响应，在配制中加入基质溶液进行配制。

1.3.2样品前处理

样品前处理按《NY/T 761-2008蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定法》中进行操作，将样本中加入0.05、0.1、0.2、0.5mg/Kg的混合标液，每个样本7个平行。

1.3.3分离条件的选择

有报道用乙腈-水、乙腈-乙酸溶液、甲醇-乙酸溶液和甲醇-水作为流动相进行氨基甲酸酯类的液相检测，结果显示：乙腈-乙酸铵溶液和甲醇-乙酸铵溶液体系对10种氨基农药的分离效果和离子化程度都不如乙腈-甲酸溶液。因此，本试验在前人的基础上提高了流动相中有机相的比列，考察了只用乙腈-水和甲醇-水作为流动相，同时调整了流动相的流速。将配制好的标准品，按从低到高的浓度上机检测，检测条件为：FLD激发波长λex 330nm,发射波长λem 465nm，柱温为42℃，进样量为20uL，柱后衍生系统NaOH溶液和OPA的流速为0.3mL/min，水解温度为100℃，衍生温度为室温。优化后的色谱洗脱程序如表1所示。

表 01 优化的梯度洗脱程序

Table1 Optimizationof the gradient elution conditions

时间（min)	水(%)	乙腈(%)	流速(mL/min)
0.00	80	20	1.0
2.00	80	20	1.0
17.00	10	90	1.0
18.00	5	95	1.0
19.00	5	95	1.0
20.00	80	20	1.0
22.00	80	20	1.0

1.3.4样品测定

在优化色谱条件下，待仪器稳定后，重复进样待相邻两针的响应值变化小于2.0%时，按标准溶液-样品溶液-样品溶液-标准溶液的顺序进样，以标准品的保留时间定性，以样品溶液峰面积和标准溶液峰面积比较定量。
2 结果与分析
2.1优化后色谱图
为了获得最佳分离效果，本试验以乙腈-水和甲醇-水作为流动相进行试验，最终采用乙腈-水作为流动相，优化了有机相的比例和流速，得到的色谱图如图1所示，结果表明，以乙腈-水作流动相时同浓度的混合标准溶液响应明显高于甲醇-水，提高乙腈浓度后，洗脱能力增强，当从20%线性增加到90%的过程中，所有10组分全部被洗脱出来，分析时间缩短至17min内，相同添加浓度的响应也比用甲醇-水作流动相高了一倍以上，本试验中采用了等流速，结果使得基线更为平稳。

（a）优化前氨基甲酸酯类农药色谱图（b）优化后氨基甲酸酯类农药色谱图

(a) The chromatograms before optimization the elution conditions (b) The chromatograms after optimization theelution conditions

图1洗脱条件优化前、后氨基甲酸酯类农药色谱图

Fig1 Carbamate pesticides HPLC chromatograms of elution conditions before and afteroptimization

2.2检出限和线性范围
配制的标准工作溶液注入高效液相色谱仪，以优化后的条件进行测定，以质量分数为横坐标、相应的峰面积为纵坐标，线性回归得10种氨基甲酸类农药的标准曲线方程、相关系数和检出限如表2所示，结果显示：10种氨基甲酸酯类农药在0.05-0.5mg/Kg范围内线性良好，相关系数除涕灭威亚砜为0.9975外，其它均为1.0，检出限为0.001-0.007mg/Kg，满足农药残留定量分析要求。

表2 10种氨基甲酸类农药残留的回归方程、相关系数和检出限

Table2 Reproducibilities, linearityand linits of detection(LODs) the 10 carbamate pesticides

农药名称	回归方程（范围内）	相关系数	检出限（mg/Kg）
涕灭威亚砜	y = 77.008x + 0.4723	0.9975	0.004
涕灭威砜	y = 69.367x - 0.1012	1.000	0.001
灭多威	y = 120.07x + 0.1902	1.000	0.007
三羟基克百威	y = 76.367x + 0.0559	1.000	0.005
涕灭威	y = 88.565x + 0.0588	1.000	0.001
速灭威	y = 124.07x + 0.0807	1.000	0.003
克百威	y = 93.676x + 0.1569	1.000	0.003
甲萘威	y = 148.49x + 0.1839	1.000	0.007
异丙威	y = 103.01x + 0.0811	1.000	0.002
仲丁威	y = 94.202x + 0.0875	1.000	0.002

2.4 组分响应
以添加浓度为0.1mg/Kg比较以甲醇-水作为流动相和以乙腈-水作为流动相的保留时间、峰高以及峰面积，如表3、表4所示。由表3、表4可知，0.1、0.5 mg/Kg两种添加浓度下，色谱条件优化前后，二者的保留时间具有较大的差异，优化后节约了更多的检测时间，0.1、0.5 mg/Kg添加浓度下仲丁威的出峰时间缩短最多，提前了4.14min，涕灭威砜的出峰时间节约最少，为2.26min，优化条件后10组分在17min内完全出峰，平均提前了3.54min。且0.1 、0.5 mg/Kg两种浓度的峰高和峰面积均大于优化前，峰高是之前的1.65-4.14倍，峰面积是1.62-3.97倍。

表3优化前后10个农药组分的响应（0.1 mg/Kg）

Table3 The 10 carbamate pesticidesof the response before and after optimization（0.1mg/Kg）

样品名称	平均保留时间（min）			平均峰高(LU)			平均峰面积
样品名称	优化前	优化后	节约时间	优化前	优化后	倍数	优化前	优化后	倍数
涕灭威亚砜	7.767	4.383	3.384	0.268	0.839	3.130	4.392	11.969	2.725
涕灭威砜	8.573	6.303	2.270	0.316	0.522	1.650	4.217	6.831	1.620
灭多威	10.171	7.490	2.681	0.472	0.991	2.099	5.968	12.247	2.052
三羟基克百威	13.248	9.334	3.914	0.233	0.748	3.208	2.726	7.706	2.827
涕灭威	15.756	11.986	3.770	0.270	0.861	3.187	3.093	8.957	2.896
速灭威	16.598	12.842	3.756	0.333	1.225	3.684	3.865	12.569	3.252
克百威	17.341	13.651	3.689	0.250	0.916	3.662	3.045	9.564	3.141
甲萘威	18.078	14.187	3.890	0.443	1.451	3.276	5.148	15.092	2.931
异丙威	19.121	15.075	4.046	0.246	1.005	4.083	2.664	10.426	3.913
仲丁威	20.439	16.300	4.140	0.221	0.915	4.142	2.509	9.516	3.793

表4优化前后10个农药组分的响应（0.5 mg/Kg）

Table4 The 10 carbamate pesticides of the response before andafter optimization（0.5 mg/Kg）

样品名称	平均保留时间（min）			平均峰高(LU)			平均峰面积
样品名称	优化前	优化后	节约时间	优化前	优化后	倍数	优化前	优化后	倍数
涕灭威亚砜	7.728	4.382	3.346	1.036	3.110	3.002	21.284	38.767	1.821
涕灭威砜	8.543	6.281	2.262	1.347	2.416	1.794	20.906	34.588	1.654
灭多威	10.147	7.472	2.675	2.206	4.668	2.116	29.978	60.204	2.008
三羟基克百威	13.227	9.320	3.907	1.162	3.650	3.140	14.197	38.230	2.693
涕灭威	15.737	11.976	3.761	1.397	4.235	3.032	16.890	44.329	2.625
速灭威	16.580	12.833	3.748	1.652	6.016	3.642	19.586	62.092	3.170
克百威	17.325	13.643	3.682	1.201	4.493	3.743	14.004	46.985	3.355
甲萘威	18.065	14.180	3.884	2.153	7.123	3.309	24.804	74.415	3.000
异丙威	19.111	15.068	4.043	1.255	4.946	3.940	13.924	51.572	3.704
仲丁威	20.432	16.295	4.137	1.094	4.513	4.126	12.197	47.181	3.868

2.3 精密度

计算并比较发现用乙腈-水作为流动相，样本重复7次所得10种农药各参数RSD值均低于优化前（以样本加标浓度为0.1mg/Kg为例），如表5所示。由表5可知，条件优化后，10种氨基甲酸酯类农药检测的保留时间、峰高和峰面积RSD都小于以15:85的甲醇-水作流动相的相对标准偏差，（最大相差了1.555），因此可见以乙腈-水作为流动相检测果蔬中氨基甲酸酯类农药精密度更高。

表5优化前后10个农药各参数相对标准偏差（0.1mg/Kg）

Table4 Parameters RSDs of the 10carbamate pesticides before and after optimization（0.1mg/Kg）

样品名称	平均保留时间RSD			平均峰高RSD			平均峰面积RSD
样品名称	优化前	优化后	差值	优化前	优化后	差值	优化前	优化后	差值
涕灭威亚砜	0.215	0.116	0.099	0.323	0.377	-0.054	0.927	0.621	0.306
涕灭威砜	0.177	0.111	0.066	0.615	0.575	0.04	1.877	0.322	1.555
灭多威	0.129	0.046	0.083	0.746	0.381	0.365	0.721	0.305	0.416
三羟基克百威	0.078	0.033	0.045	0.578	0.282	0.297	0.689	0.181	0.509
涕灭威	0.063	0.029	0.034	0.868	0.241	0.627	1.422	0.263	1.159
速灭威	0.063	0.023	0.04	0.453	0.195	0.257	0.623	0.181	0.441
克百威	0.058	0.026	0.032	0.554	0.181	0.373	0.562	0.115	0.447
甲萘威	0.059	0.02	0.039	0.346	0.145	0.201	0.42	0.165	0.256
异丙威	0.055	0.019	0.036	0.807	0.19	0.618	0.861	0.111	0.75
仲丁威	0.048	0.019	0.029	0.723	0.236	0.488	0.891	0.161	0.73

3 小结与讨论
有文章报道和《NY/T 761-2008》都采用乙腈作为样品前处理的提取液，能比甲醇、丙酮等更有效的提取该类农药，说明该类农药在乙腈中的溶解度更好，因此本研究用乙腈替代甲醇作流动相。在《NY/T761-2008》的基础上，将流动相改为乙腈-水，实验结果显示，条件优化后，对样品中10种氨基甲酸酯类农药的洗脱能力得以增强，改善了这10农药的色谱峰形，使得出峰时间大大提前，节约了样品检测的时间；10种农药分离度好，峰面积、峰高响应良好，减少了假阳性的出现，提高了检测的准确度，是一种比较理想的检测方法，具有较强的可行性和实用性。在研究中，我们仅用乙腈替代了甲醇，没有加入甲酸溶液，也能达到有效分离的效果，加入的甲酸溶液改变了流动相的pH值，对仪器有一定的污染，因此，我们用乙腈-水作为本试验的流动相，即能有效分离，不污染仪器，又经济节约。
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附件：

高效液相色谱法测定氨基甲酸酯类农药的条件优化.doc