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快速测定参枝苓口服液中肉桂酸含量的方法

qindong413

2016/09/29

私聊

中药/天然药检测

摘要：目的 建立一种快速测定参枝苓口服液中肉桂酸含量的方法。方法首先采用高效液相色谱法测定参枝苓口服液中肉桂酸含量，做为一级数据，并同时采集样品的近红外光谱；采用K-S方法对样品集进行划分考察不同的光谱预处理方法，以Rc、Rv、RMSECV、RMSEP值为模型评价指标。结果最佳模型Rc、Rv、RMSECV、RMSEP值分别为0.8862、0.8877、0.00282、0.00301。线性较好，光谱与样品的肉桂酸含量有较好的相关性。结论建立的参枝苓口服液中肉桂酸含量模型满足生产需求，是一种快速无损、经济的检测方法。

关键词：近红外光谱分析技术参枝苓口服液肉桂酸

参枝苓口服液是我国首个批准用于老年痴呆的中药复方药物，适用于轻中度阿尔茨海默病所引起的心气虚证，表现症状为心慌心悸、气虚少语、神情冷漠、头晕乏力、失眠健忘、舌淡脉虚等症。组方包括党参、桂枝、茯苓和白芍等10味中药，其中桂枝是主要药材之一，桂枝中主要含有肉桂酸、桂皮醛等成分在药效中起到关键作用。因此，可以通过检测复方中肉桂酸的含量来检验和控制参枝苓口服液的药品质量。目前使用的含量检测方法为HP$$lc法，该方法比较复杂，不利于实现在线控制。近红外光谱分析技术（Near Infrared Spectroscopy，NIRS）是当前最重要的一种PAT技术，它是指应用波长范围在780-2526nm波长范围内的电磁波的一种快速绿色无损光谱学分析方法并且已经开始广泛应用于农副产品检测、食品检测、药物检测、石油化工产品检测、烟草检测等领域。本实验采用NIRS方法对复方中肉桂酸含量进行测定。

1仪器与材料
1.1试剂

乙腈、甲醇为色谱纯（Merck, Darmstadt, Germany），磷酸为色谱纯（Tedia公司）。肉桂酸对照品购自中国药品生物制品检定所（北京），其余试剂均为分析纯。

1.2样品
收集四批（生产批号分别为14311、14312、14313、14314）共85个样品，所有样品均有潍坊沃华医药有限公司提供。
1.3仪器
Agilent 1200高效液相色谱仪，四元泵、DAD检测器、ALS自动进样器、柱温箱Chem-Station for $$lc 3工作站；柱子型号：Aglient Eclipse Plus C18柱（4.6×250mm，4.6um）；Millipore超纯水器（美国Millipore公司）；AntarisⅡ傅里叶变换近红外光谱仪（美国Thermo Fisher公司），配有透射模块采样系统和Result操作软件；其他玻璃仪器。光谱处理及模型建立采用Matlab 软件和TQ 软件。
2方法
2.1近红外光谱的采集
采集光谱所用的近红外光谱仪器为美国Thermo Fisher公司生产的AntarisⅡ傅里叶变换近红外光谱仪；将适量样品置于4mm的玻璃样品管中进行光谱采集，光谱采集范围为4000 -10000 cm^-1；扫描次数为32；分辨率为8 cm^-1；增益值为4x，常温环境采集光谱。每次采集样品前采集背景光谱来消除背景的影响。每个样品的测量时间小于1 min。
2.2 HP$$lc测定芍药苷含量
本实验采用HP$$lc方法作为参考方法来测量样品肉桂酸含量的一级数据。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸溶液（25：75）为流动相，待肉桂酸色谱峰出峰后，再用乙腈为流动相洗脱10分钟；检测波长为278nm。理论板数按肉桂酸峰计算应不低于12000。
取肉桂酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶液制成每47.1μg/ml的标准品溶液，即得对照品溶液。精密量取本品10ml，置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液。
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件，1ml/min流速下等度洗脱50min，记录对应峰面积，外标一点法计算含量。
2.3近红外光谱技术分析
采用PLS方法将样品液相一级数据与近红外光谱(二级数据)相关联，通过光谱预处理方法的选择、光谱建模区间的选择以及其他建模参数的优化，建立稳健的定量分析模型，并以模型的RMSEC、RMSEP、Rc和Rv值作为模型结果的评价指标。
2.3.1校正集和验证集的划分
所有的样品划分为校正集和验证集。样品集划分的方法有随机样品划分法（RS），KS法以及SPXY法。在本实验中采用KS法将样品划分为校正集和验证集。KS方法是基于光谱变量的选择方法。根据约4:1的比列将样品划分为68个校正集和17个验证集。
2.3.2光谱建模区间的选择
本实验分别采用全光谱（4000-10000cm^-1）区间以及TQ软件所建议优化的区间（8327-5457cm^-1）建立样品的PLS，以R_c、R_v、RMSECV、RMSEP值为参数对模型进行比较，选出最佳的建模光谱区间。
2.3.3光谱预处理方法的选择
近红外光谱中包含复杂的样品化学信息，在分析过程中，近红外光谱受多种因素的干扰。在建立校正模型之前需要采用化学计量学的方法对光谱作适当的预处理以减少或消除这些影响，改善模型的性能。本实验分别采用SG15、MSC、SNV以及SG15+1d对原始光谱进行预处理并建立PLS数学模型。以R_c、R_v、RMSECV、RMSEP值为参数对模型进行比较，选出最佳的预处理方法。
2.3.4模型的建立与模型的评价
选用最佳的预处理方法和优化的光谱区间建立PLS模型，用验证集样品对最终模型进行外部验证，并以R_c、R_v、RMSECV、RMSEP值作为模型性能的评价指标。
3结果
3.1参枝苓口服液肉桂酸含量测定HP$$lc数据分析

表1 参枝苓口服液肉桂酸含量测定统计表

样品号	编号	峰面积	浓度µg/ml	含量mg/ml
14311成品-01	1	4565.9	58.663	0.147
14311成品-02	2	4540.8	58.340	0.146
14311成品-03	3	4675.9	60.076	0.150
14311成品-04	4	4644.3	59.670	0.149
14311成品-05	5	4618.7	59.341	0.148
14311成品-06	6	4710	60.514	0.151
14311成品-07	7	4652.5	59.775	0.149
14311成品-08	8	4453.6	57.220	0.143
14311成品-09	9	4387.4	56.369	0.141
14311成品-10	10	4426.9	56.877	0.142
14311成品-11	11	4608.1	59.205	0.148
14311成品-12	12	4610.1	59.231	0.148
14311成品-13	13	4636.8	59.574	0.149
14311成品-14	14	4430.6	56.924	0.142
14311成品-15	15	4624.5	59.416	0.149
14311成品-16	16	4602.3	59.130	0.148
14311成品-18	17	4505.2	57.883	0.145
14311成品-19	18	4667.9	59.973	0.150
14311成品-20	19	4655.8	59.818	0.150
14311成品-21	20	4694.3	60.312	0.151
14311成品-23	21	4617.9	59.331	0.148
14312成品-01	22	4398.5	55.161	0.138
14312成品-02	23	4686.4	58.772	0.147
14312成品-03	24	4561.4	57.204	0.143
14312成品-04	25	4453.0	55.845	0.140
14312成品-05	26	4579.6	57.432	0.144
14312成品-06	27	4657.3	58.407	0.146
14312成品-08	28	4436.5	55.638	0.139
14312成品-09	29	4644.0	58.240	0.146
14312成品-10	30	5068.7	63.566	0.159
14312成品-11	31	4614.2	59.757	0.149
14312成品-12	32	4409.1	57.100	0.143
14312成品-13	33	4602.2	59.601	0.149
14312成品-14	34	4538.7	58.779	0.147
14312成品-15	35	4544.2	58.850	0.147
14312成品-16	36	4538.0	58.770	0.147
14312成品-17	37	4550	58.925	0.147
14312成品-19	38	4434.9	57.435	0.144
14312成品-20	39	4645.2	60.158	0.150
14312成品-21	40	4466.7	57.846	0.145
14312成品-22	41	4528.7	58.649	0.147
14313成品-01	42	4823.6	61.203	0.153
14313成品-02	43	5033.3	63.864	0.160
14313成品-03	44	4902.6	62.206	0.156
14313成品-04	45	5011.4	63.586	0.159
14313成品-05	46	4920.8	62.437	0.156
14313成品-06	47	5042.2	63.977	0.160
14313成品-07	48	5056.2	64.155	0.160
14313成品-08	49	4953.5	62.852	0.157
14313成品-09	50	4842.2	61.439	0.154
14313成品-10	51	4976.6	63.145	0.158
14313成品-11	52	4829.6	61.280	0.153
14313成品-12	53	5020.8	63.706	0.159
14313成品-13	54	5093.9	64.633	0.162
14313成品-14	55	5090.4	64.589	0.161
14313成品-15	56	5035.2	63.888	0.160
14313成品-16	57	5046.8	64.035	0.160
14313成品-17	58	5080.6	64.464	0.161
14313成品-18	59	5055.2	64.142	0.160
14313成品-19	60	5063.5	64.247	0.161
14313成品-20	61	5058.2	64.180	0.160
14313成品-21	62	5026.2	63.774	0.159
14313成品-22	63	5046.0	64.025	0.160
14314成品-01	64	4978.4	62.979	0.157
14314成品-02	65	4835.5	61.171	0.153
14314成品-03	66	4937.2	62.458	0.156
14314成品-04	67	4957.8	62.718	0.157
14314成品-05	68	4876.3	61.687	0.154
14314成品-06	69	4980.7	63.008	0.158
14314成品-07	70	4925	62.303	0.156
14314成品-08	71	4968.2	62.850	0.157
14314成品-09	72	5032.6	63.665	0.159
14314成品-10	73	4820	60.975	0.152
14314成品-11	74	4954	62.670	0.157
14314成品-12	75	4901.6	62.007	0.155
14314成品-13	76	4980.3	63.003	0.158
14314成品-14	77	4902.8	62.023	0.155
14314成品-15	78	5032.7	63.666	0.159
14314成品-16	79	4911.1	62.128	0.155
14314成品-17	80	4946.7	62.578	0.156
14314成品-18	81	4990.2	63.128	0.158
14314成品-19	82	4956	62.696	0.157
14314成品-20	83	4894.1	61.912	0.155
14314成品-21	84	4896.5	61.943	0.155
14314成品-22	85	5046.3	63.838	0.160

由表1可知，各样品肉桂酸含量分布较为均匀，初步说明实验中所采用的四批次85个参枝苓口服液样品肉桂酸含量一致性是可以接受的。
3.2近红外光谱技术分析
3.2.1校正集和验证集的划分结果

表2 KS分类的样品集信息

样品集	样品个数	含量范围mg/ml	含量平均值mg/ml
校正集	68	0.138-0.161	0.151
验证集	17	0.144-0.162	0.156

图1主成分得分图

由图1可以看出，验证集样品分布在校正集样品范围内，说明样品集划分合理，满足分析要求。

3.2.2光谱预处理方法和光谱区间的选择
本实验分别在全光谱和TQ软件建议光谱区间内，对光谱做SG15、SG15+1d、MSC以及SNV处理，比较各种组合的R_c、R_v、RMSECV、RMSEP值，最终选出最优建模光谱区间和光谱预处理方法。各模型评价参数比较直观反映如表3所示。

表3 不同预处理方法、光谱区间的模型评价参数

光谱预处理方法	光谱区间/cm^-1	RMSECV	R_c	RMSEP	R_v	主因子数
原始光谱	10000-4000	0.00125	0.9787	0.00323	0.8632	10
原始光谱	8327-5457	0.00120	0.9804	0.00354	0.7969	10
SG15	10000-4000	0.00278	0.8899	0.00326	0.8661	8
SG15	8327-5457	0.00184	0.9533	0.00267	0.8858	10
SG15+1d	10000-4000	0.00191	0.9497	0.00500	0.5266	5
SG15+1d	8327-5457	0.00187	0.9516	0.00473	0.6351	6
MSC	10000-4000	0.00282	0.8862	0.00301	0.8877	6
MSC	8327-5457	0.00084	0.9904	0.00364	0.7834	10
SNV	10000-4000	0.00282	0.8862	0.00301	0.8873	6
SNV	8327-5457	0.00084	0.9906	0.00366	0.7834	10

由上表可以看出，原始光谱与全光谱区间组合所建模型和SG15变换光谱与软件建议光谱区间所建模型效果较好，但是建模主因子数为10，明显高于MSC转化光谱在全光谱内建模的主因子数。综合考虑校正集、验证集的结果以及主因子数的影响，最终选择MSC转化光谱在全光谱建模区间建模结果为最佳模型，模型主因子数为6。

图2 Press图

由图2可以看出，当主因子数为6时，Press值达到最小值，因此选择主因子数为6是可以接受的。
3.2.4模型的建立与模型的评价
综上所诉，本实验选择MSC光谱预处理方法在全光谱区间内所建模型为参枝苓口服液中肉桂酸含量测定的最佳PLS定量模型。模型具体参数如表4所示，样品含量预测值和实际值的统计表如表5所示。

表4 模型具体参数

光谱预处理方法	光谱区间/cm^-1	RMSECV	R_c	RMSEP	R_v	主因子数
MSC	4000-10000	0.00282	0.8862	0.00301	0.8877	6

表5 样品含量预测值和实际值的统计表

样品号	实际含量mg/ml	预测值mg/ml	误差mg/ml	相对误差(%)
14311成品-01	0.147	0.145	-0.002	1.36
14311成品-02	0.146	0.146	0	0.00
14311成品-03	0.150	0.147	-0.003	2.00
14311成品-04	0.149	0.150	0.001	0.67
14311成品-05	0.148	0.149	0.001	0.68
14311成品-06	0.151	0.149	-0.002	1.32
14311成品-07	0.149	0.149	0	0.00
14311成品-08	0.143	0.142	-0.001	0.70
14311成品-09	0.141	0.142	0.001	0.71
14311成品-10	0.142	0.142	0	0.00
14311成品-11	0.148	0.148	0	0.00
14311成品-12	0.148	0.149	0.001	0.68
14311成品-13	0.149	0.147	-0.002	1.34
14311成品-14	0.142	0.144	0.002	1.41
14311成品-15	0.149	0.151	0.002	1.34
14311成品-16	0.148	0.150	0.002	1.35
14311成品-18	0.145	0.146	0.001	0.69
14311成品-19	0.150	0.151	0.001	0.67
14311成品-20	0.150	0.148	-0.002	1.33
14311成品-21	0.151	0.148	-0.003	1.99
14311成品-23	0.148	0.149	0.001	0.68
14312成品-01	0.138	0.138	0	0.00
14312成品-02	0.147	0.149	0.002	1.36
14312成品-03	0.143	0.144	0.001	0.70
14312成品-04	0.140	0.142	0.002	1.43
14312成品-05	0.144	0.147	0.003	2.08
14312成品-06	0.146	0.151	0.005	3.42
14312成品-08	0.139	0.141	0.002	1.44
14312成品-09	0.146	0.147	0.001	0.68
14312成品-10	0.159	0.153	-0.006	3.77
14312成品-11	0.149	0.151	0.002	1.34
14312成品-12	0.143	0.142	-0.001	0.70
14312成品-13	0.149	0.148	-0.001	0.67
14312成品-14	0.147	0.146	-0.001	0.68
14312成品-15	0.147	0.149	0.002	1.36
14312成品-16	0.147	0.150	0.003	2.04
14312成品-17	0.147	0.146	-0.001	0.68
14312成品-19	0.144	0.146	0.002	1.39
14312成品-20	0.150	0.152	0.002	1.33
14312成品-21	0.145	0.144	-0.001	0.69
14312成品-22	0.147	0.144	-0.003	2.04
14313成品-01	0.153	0.151	-0.002	1.31
14313成品-02	0.160	0.159	-0.001	0.63
14313成品-03	0.156	0.153	-0.003	1.92
14313成品-04	0.159	0.158	-0.001	0.63
14313成品-05	0.156	0.155	-0.001	0.64
14313成品-06	0.160	0.160	0	0.00
14313成品-07	0.160	0.158	-0.002	1.25
14313成品-08	0.157	0.155	-0.002	1.27
14313成品-09	0.154	0.154	0	0.00
14313成品-10	0.158	0.159	0.001	0.63
14313成品-11	0.153	0.153	0	0.00
14313成品-12	0.159	0.159	0	0.00
14313成品-13	0.162	0.157	-0.005	3.09
14313成品-14	0.161	0.161	0	0.00
14313成品-15	0.160	0.160	0	0.00
14313成品-16	0.160	0.158	-0.002	1.25
14313成品-17	0.161	0.157	-0.004	2.48
14313成品-18	0.160	0.159	-0.001	0.63
14313成品-19	0.161	0.156	-0.005	3.11
14313成品-20	0.160	0.157	-0.003	1.88
14313成品-21	0.159	0.159	0	0.00
14313成品-22	0.160	0.159	-0.001	0.63
14314成品-01	0.157	0.159	0.002	1.27
14314成品-02	0.153	0.154	0.001	0.65
14314成品-03	0.156	0.157	0.001	0.64
14314成品-04	0.157	0.158	0.001	0.64
14314成品-05	0.154	0.156	0.002	1.30
14314成品-06	0.158	0.158	0	0.00
14314成品-07	0.156	0.157	0.001	0.64
14314成品-08	0.157	0.156	-0.001	0.64
14314成品-09	0.159	0.159	0	0.00
14314成品-10	0.152	0.154	0.002	1.32
14314成品-11	0.157	0.159	0.002	1.27
14314成品-12	0.155	0.157	0.002	1.29
14314成品-13	0.158	0.157	-0.001	0.63
14314成品-14	0.155	0.157	0.002	1.29
14314成品-15	0.159	0.157	-0.002	1.26
14314成品-16	0.155	0.157	0.002	1.29
14314成品-17	0.156	0.159	0.003	1.92
14314成品-18	0.158	0.154	-0.004	2.53
14314成品-19	0.157	0.159	0.002	1.27
14314成品-20	0.155	0.155	0	0.00
14314成品-21	0.155	0.156	0.001	0.65
14314成品-22	0.160	0.160	0	0.00

由表5可知，只有极少数个（3个）样品的预测值相对误差大于3%，说明模型预测值的准确性是可靠的，一定程度上可以补充甚至代替传统的HP$$lc方法。
4结论
本实验收集四个生产批次共85个参枝苓口服液成品样品，采用HP$$lc方法获取参枝苓口服液中主要成分肉桂酸含量的一级数据，用ANTARIS II 近红外光谱仪采集样品近红外光谱，并用PLS方法将样品肉桂酸含量一级数据与样品近红外光谱进行关联，建立定量分析模型。经光谱预处理方法的选择和模型建模区间的优化，最终选择MSC转换光谱在全光谱区间建模为最佳模型。以R_c、R_v、RMSECV、RMSEP值为模型评价指标，最佳模型R_c、R_v、RMSECV、RMSEP值分别为0.8862、0.8877、0.00282、0.00301。模型采用主因子数为6。模型参数均满足分析要求。本实验为参枝苓口服液成品质量在线控制和一致性考察提供了一种新的参考方法。
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