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连翘苷解热作用的三个直接靶点及机制

小卡

2024/09/09

中药/天然药检测

发热是多种疾病急性期的主要病理生理反应之一，体温过高可导致脑组织损伤、免疫反应异常等多种不良后果。连翘为连翘科植物连翘的干燥果实，临床上长期用于治疗感冒或流感引起的发热。连翘是双黄连口服液、清热解毒口服液、连翘口服液、银翘解毒颗粒等中药制剂的主要原料。连翘苷（Phllyrin，Phr）是连翘中的主要有效成分,在体内可代谢为连翘皂苷（Phg）、Phg-磺酸盐（Phg-S）和Phg-葡萄糖醛酸（Phg-G）等,具有解热作用，但Phr及其代谢物的解热作用机制尚不明确。

2024年8月22日，南开大学药学院白钢/姜民团队在Phytomedicine上发表了题为“Phillyrin and its metabolites exert antipyretic effects bytargeting the NAD+ binding domain of GAPDH, MDH2 and IDH2”的文章，发现连翘主要药效学成分Phr有显著的解热作用，且Phr的解热作用与其代谢物Phg靶向甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、苹果酸脱氢酶2（MDH2）和异柠檬酸脱氢酶2（IDH2）的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）结合域，抑制其酶活性。
1、Phr对肺炎发热小鼠模型具有抗炎、解热作用

作者首先通过鼻内滴注LPS诱导的小鼠肺炎发热模型中验证了Phr的解热作用。结果显示，LPS诱导的小鼠体温明显升高，而阿司匹林和Phr有效地抑制LPS诱导的体温升高。此外，阿司匹林和Phr显著增强了发热小鼠肝脏温敏探针的荧光强度（荧光强度与温度成反比），表明阿司匹林和Phr减少了发热状态下的肝脏产热。作者还发现Phr和阿司匹林在LPS诱导的肺炎发热模型中显示出较强的抗炎作用，表现为炎症细胞浸润减少，肺损伤评分降低，肺系数和肺W/D重量比增加。这些结果表明Phr在体内具有显著的解热和抗炎作用。

2、Phr的解热作用可能与其主要代谢产物Phg作用于GAPDH、IDH2和MDH2有关

作者发现Phr在体内主要代谢为Phg、Phg-s和Phg-g。通过使用线粒体温敏探针分析了Phr及其代谢物对细胞线粒体温度的影响，证实Phr及其代谢产物在一定浓度下有效地抑制了线粒体温度，但是0.1μM Phg仍对线粒体温度有显著的抑制作用，而相同浓度的Phg-s和Phg-g均无抑制作用，提示Phg可能是Phr发挥解热作用的主要活性形式。

为了鉴定Phr体内解热作用的靶蛋白，作者合成了Phr的主要活性解热代谢产物Phg的炔基探针，通过Pulldown+MS初步鉴定出47个蛋白质为Phg的潜在靶点，鉴于能量代谢是体内产热的主要途径之一，进一步对捕获的蛋白质和能量代谢相关基因进行交集，发现其中GAPDH、MDH2、IDH2蛋白与能量代谢相关。通过WB、细胞共定位分析、竞争分析验证了Phg与三个靶蛋白的结合。综上所述，Phg是Phr发挥解热作用的主要活性形式，其解热作用可能与Phg靶向GAPDH、MDH2和IDH2蛋白，进一步调节能量代谢，影响产热有关。

3、Rossmann折叠被确定为Phg靶向GAPDH, IDH2和MDH2的结合口袋

为了确定Phg与GAPDH, IDH2和MDH2的结合机制，作者从蛋白质的结构-功能分析开始，并使用目标蛋白的天然底物和配体干扰目标蛋白被Phg捕获。结果显示，NAD+依赖的GAPDH、MDH2、IDH2酶活性测定表明，Phg竞争性抑制了参与NAD+的GAPDH、MDH2、IDH2酶活性，并通过分子对接分析了结合模式。GAPDH, MDH2和IDH2是核苷酸结合酶，它们的蛋白质结构包含辅酶NAD+结合口袋，称为Rossmann折叠。因此，作者推测Phg可能与NAD+竞争，与这些靶蛋白的Rossmann折叠结合，从而抑制其活性。

4、Phg非共价结合于GAPDH的Asp35和Asn316残基，并竞争性占据NAD+的Rosmann折叠结构域

Rossmann折叠由两个重复的β-α-β-α-β拓扑结构组成，NAD+和Rossmann折叠中的氨基酸残基之间的氢键相互作用诱导GAPDH的构象变化。为了进一步验证Phg与NAD+竞争结合靶蛋白的Rossmann折叠的假设，作者以GAPDH蛋白为例，对比分析了NAD+和Phg与GAPDH蛋白的相互作用。通过圆二色谱实验、FQ实验、SPR分析、分子对接分析、fit实验、蛋白点突变实验证实Phg通过结合GAPDH的rosman折叠中的Asp35和Asn316残基，竞争性地抑制了NAD+与GAPDH的结合，从而抑制了目标蛋白的酶活性。

5、Phg通过靶向GAPDH、MDH2和IDH2影响细胞能量代谢

作者进一步研究了Phg对GAPDH, MDH2和IDH2酶活性的影响，发现Phg抑制了细胞中三种酶的活性。GAPDH、MDH2和IDH2参与了能量代谢途径中TCA过程。因此，作者通过代谢组学检测了phg对TCA代谢的影响，发现相关代谢物显著变化，进一步结合线粒体应激实验证实Phg靶向GAPDH、MDH2和IDH2来抑制TCA和OXPHOS过程，从而减少线粒体的能量和产热。

6、Phr通过作用于GAPDH、MDH2和IDH2发挥体内解热和抗炎作用

作者进一步验证Phr的体内解热抗炎作用是否与GAPDH、MDH2、IDH2的靶向作用有关。酶活性检测显示，肺炎发热模型小鼠血清中GAPDH、MDH2和IDH2的酶活性显著升高，而Phr显著抑制了这三种蛋白酶活性的升高。此外，模型小鼠血清中由这三种蛋白调节的NAD+/NADH比值显著降低，ATP含量显著升高，而Phr有效地逆转了这两项指标的变化。这些结果表明，Phr对肺炎发热模型小鼠的体内解热作用与其主要代谢产物Phg密切相关，Phg靶向作用于GAPDH、MDH2和IDH2，影响能量代谢通路。

作者进一步阐明了Phr在肺炎发热小鼠模型中的抗炎机制。免疫荧光定位分析显示，Phg特异性靶向肺炎热小鼠肺组织中的肺巨噬细胞，提示巨噬细胞可能是其在体内发挥抗炎作用的靶细胞。。除参与能量代谢途径外，作者发现GAPDH还可通过多种途径直接或间接影响TNF-α、il-1β、IL-6等炎症因子的产生，并与其酶活性呈正相关。提示Phr在肺炎小鼠体内的抗炎作用可能与其代谢产物Phg特异性靶向肺巨噬细胞中GAPDH，抑制其酶活性，从而抑制相关炎症因子的产生有关。

7、Phg和Phg-s是Phr在体内作用于GAPDH、MDH2和IDH2的主要活性形式

由于Phg-S和Phg-G也是Phr在体内的主要代谢产物，作者进一步通过体外蛋白-分子相互作用实验验证它们是否也能靶向GAPDH、MDH2和IDH2。通过SPR证实Phr及其代谢产物与3种蛋白的结合顺序为Phg>Phg-s>Phr,Phg-g未与3种蛋白中的任何一种结合。FTS检测结果显示Phr及其代谢产物提高了GAPDH、MDH2和IDH2的热稳定性，Phg和Phg-s的作用比Phr和Phg更强。体外酶活性检测显示，Phg和Phg-s对GAPDH、MDH2和IDH2的酶活性有明显的抑制作用，而Phr和Phg-g对这3种蛋白的酶活性没有抑制作用。结果表明Phg和Phg-s可能是Phr在体内靶向GAPDH, MDH2和IDH2的主要活性形式。

总结

研究阐明了调节能量代谢可通过减少能量供应和调节发热相关炎症因子发挥解热作用，发现连翘主要药效学成分Phr的解热作用与其代谢产物Phg和Phg-s有关，Phg和Phg-s作用于GAPDH、IDH2和MDH2的NAD+结合域，从而抑制酶活性和能量代谢。本研究为改善发热的治疗提供了新的视角。主要内容如下：

Phr在脂多糖诱发的发热小鼠模型中表现出明显的解热和抗炎作用。Phg可逆性靶向甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH)、苹果酸脱氢酶 2 (MDH2) 和异柠檬酸脱氢酶 2 (IDH2) 的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+)结合域，抑制其酶活性。对细胞代谢组学和线粒体应激测试的深入分析表明，Phg抑制 GAPDH、MDH2 和 IDH2 酶活性导致糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化信号通路调节的细胞能量供应和产热减少。此外，Phg特异性靶向巨噬细胞，通过下调GAPDH酶活性抑制 LPS 诱导的巨噬细胞活化，从而发挥抗炎作用。体内实验也证实，Phr在LPS诱导的发热模型小鼠中的解热作用与其主要代谢产物Phg和Phg-磺酸盐（Phg-S）有关，它们直接靶向作用于GAPDH、IDH2、MDH2的NAD +结合域，抑制这些酶的活性，从而减少能量供应，调节发热相关的炎症因子。连翘苷(Phr)的解热机制与其主要代谢产物连翘苷(Phlygenin)靶向作用于GAPDH、MDH2和IDH2的NAD+结合域，减少能量供应，调节发热相关炎症因子有关。

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xiahuanihao

第1楼2024/09/10

连翘苷解热作用很强大！

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xiahuanihao

第2楼2024/09/10

连翘苷解热，优秀中药！

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