材料中真菌类型鉴定试验分析

高秋荣

2017/09/11

私聊

食品接触材料

材料中真菌类型鉴定试验分析
西安国联质量检测技术股份有限公司
食品事业部：张锐

1 检验方法
1.1菌种分离
1.1.1 用浸湿生理盐水的无菌棉签在材料板表面涂抹，放于10mL无菌蒸馏水中，充分混匀备用。取原液1.0mL加入9.0mL无菌蒸馏水中，充分混匀为1:10样液，依次稀释至10^-²或10^-3的样液。
1.1.2 取适当稀释度样液100μL于PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂）涂布，25℃培养，连续观察，对不同形态的菌落进行分离、纯化。
1.2 形态学鉴定
1.2.1 将分离的不同菌株分别接于PDA培养基25℃培养7d观察菌落形态，并待产孢后，在显微镜下观察分生孢子、产孢器及其产孢细胞的形态。
1.3 分子鉴定
1.3.1 DNA提取：
取200g菌丝，液氮研磨，将研磨好的菌至 1.5mL离心管中混匀，加入 0.6 mL TE（pH 8.0）、 250 μL 10% SDS、3 μL 蛋白酶 K（20 ng/μL），轻轻混匀，37℃水浴 1 h；加入 150 μL 5mol/L NaCl、 150 μL 2% CTAB，轻轻混匀，65℃水浴 20 min，12000 rpm 常温离心 20 min；吸取上清液加入等体积异丙醇，充分混匀，室温放置 30 min，12000 rpm，4℃离心 10 min；吸掉上清液，在吸水纸上空干液体，加 750 μL 70%乙醇，轻弹管壁混匀，12000rpm，4℃离心 2min；加入 30 μl 纯化水溶解沉淀（水中加 Rnase，终浓度 10 ng/μL），用手轻弹管壁，4℃溶解保存。
利用真菌通用引物ITS1(5'-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A -3')、ITS4(5'-TCC TCC gcT TAT TGA TAT gc-3')和真菌特异性引物5.8s(5'-gcA TCG ATG AAG AAC gcA gc-3')、28s(5'-TCC TCC gcT TAT TGA TAT gc-3')分别对J2和J4基因组DNA进行PCR扩增，其扩增体系为：3 μLBuffer，2 μLDTP，引物各3 μL，DNA模板1 μL（以
加1 μL双蒸水为空白对照），最后用双蒸水定容到30 μL。扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后，对具特异性条带的产物进行测序。将测序结果与GenBank中的相关序列进行同源性比较，明确其种类。
2 结果与分析
2.1 菌种分离
2.1.1 经涂布法分离培养，在2种材料上均分离得到5株相同菌株，分别编号为J1、J2、J3、J4和J5。J1在油漆试件和辅助电源板黑色镶嵌模块材料上生长良好，分离频率均最高，表明2种材料均能促进J1菌丝生长，其次为J2；在油漆试件材料上J3分离频率为0，表明油漆试件材料能抑制J3 菌丝的生长；J5在2种材料上的分离频率均最低，表明2种材料对J5菌丝的生长促进缓慢（表1）。

将菌株在PDA培养基上25℃培养7d后，经形态学比对，将J1鉴定为黑曲霉，将J3鉴定为黄曲霉，将J5为鉴定杂色曲霉，均为试验菌株。J2菌落圆形，7d菌落直径4~6cm，菌丝絮状，初生菌丝白色，后变为黄色、黄绿色，培养基背面淡黄色，分生孢子穗半圆形、圆筒形，小梗1层或2层，顶囊半球形、圆拱形至球形，分生孢子球形；J4菌落圆形，7d菌落直径4~5cm，菌丝细，絮状，白色，不易产孢，产孢器扫帚状，分生孢子梗轮生，分生孢子球形。2.2 形态学鉴定
2.3 分子鉴定
利用引物ITS1/ITS4和5.8s/28s分别对J2和J4基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测（图1），以DNA Marker-DL5000为对照，具特异性条带的扩增产物进行测序，将测序结果在GenBank中进行同源序列比较，下载相似性高的序列，并用Mega(5.0)软件采用邻接法构建系统发育树。结果显示，J2 ITS基因扩增序列为607 bp，与Aspergillus oryzae (KF154415.1)相似度达99%，在系统发育树上聚在一起（图2）；J4 5.8s/28s扩增序列349 bp，在GenBank中经同源序列比较发现其与Talaromyces macrosporus(KX011505.1)的同源性在98%以上，且在系统发育树上与其聚在一起（图3），即二者亲缘关系最近。结合形态特征，将J2鉴定为米曲霉Aspergillus oryzae，将J4鉴
定为篮状菌Talaromyces macrosporus。

3 讨论

不同的供试材料能为菌株生长提供养分，该试验对接种5种试验菌株的材料在高温高湿的环境下处理，确定材料在有利于霉菌生长的条件下霉菌对他们产生的有害影响。试验结果表明，2种试验材料均能促进黑曲霉菌丝的生长，其次为米曲霉，对篮状菌菌
丝生长促进缓慢；均能抑制绳状青霉、球毛壳霉菌丝的生长。菌株是否可以在材料上
良好生长取决于供试材料能否提供该菌所需要的营养类型和培养环境是否满足菌株生长。该试验分离得到的菌株分离频率越大，表明该材料越能为菌株生长提供养分，但菌株是否对材料产生有害影响，需观察菌株对材料物理性质的影响。

分
该帖子已被版主-戎马一生为家国加5积分，加2经验;加分理由:原创