普洱茶中黄曲霉毒素普查情况

meizhengla

2017/09/18

私聊

食品毒素/微生物检测

摘要：目的 初步了解市场上普洱茶中黄曲霉毒素的污染情况。方法：随机从市场上购买23份普洱茶，样品经80%乙腈水溶液提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过免疫亲和柱净化，最后高效液相色谱法进行检测黄曲霉毒素B₁的含量。结果：23份普洱茶中均未检出黄曲霉毒素B₁，本实验室方法检出限为0.1μg/kg。
关键词：普洱茶；黄曲霉毒素B₁；污染调查
近期一则《方舟子爆料：普洱茶致癌》的文章中认为普洱茶中有各种霉菌，其中必定存在有对人体有害的黄曲霉毒素，引起社会各界人士的关注，为此各方检测机构以及知名专家也出面来为普洱茶辟谣，作为一直致力于真菌毒素检测的北京美正检测技术有限公司马上从市场上来购买了一批普洱茶，来检测其中的黄曲霉毒素毒素的污染情况，一探究竟。
1、材料与方法
1.1 材料和试剂

样本来源	数量
延庆康庄华联超市	2
云南	7
延庆恒生市场	8
京东商城	6
合计	23

北京美正检测技术有限公司共从延庆、京东和云南各地买了23份普洱茶。
黄曲霉毒素 B₁ 标准品(20μg/mL, 美国 Sigma 公司)；黄曲霉毒素免疫亲和柱(北京华安麦科生物技术有限公司)；甲醇、乙腈(提取用): 分析纯, 国药集团化学试剂北京有限公司；甲醇(液相用): 色谱级, 美国 J.T.Baker 公司。
1.2仪器设备
高效液相色谱仪（岛津LC-20AT），光化学衍生器（北京华安麦科生物技术有限公司）。
1.3 仪器条件
色谱柱： C18， 5μm， 4.6×250mm；流动相：甲醇 : 水（55:45）；流速： 0.8mL/min；柱温： 40℃；进样量： 20µL；荧光检测器：激发波长： 360nm，发射波长： 440nm；柱后光化学衍生法：光化学衍生器。
1.4 方法对比
1.4.1 提取
称取粉碎后的样品 5.0 g 于 50 mL具塞离心管中，分别加入25 mL 乙腈-水 ( 80∶20， V /V)，25mL 甲醇-水（70:30，V/V）和25mL 纯甲醇，2500rpm/min，涡旋震荡10min，4000rpm/min离心5min后，上清液备用。取10.0 mL滤液加入40.0 mL 0.1%吐温稀释，用玻璃纤维滤纸过滤 1 次～ 2 次，至滤液澄清，备用。
1.4.2 净化
将免疫亲和柱连接于10.0 mL注射器下。准确移取25.0 mL样品提取液注入注射器中，将空气压力泵与注射器连接，调节压力使溶液以约 3-4mL /min 流速缓慢通过免疫亲和柱，直至 2 mL ～ 3 mL 空气通过柱体。用10mL水洗涤两次后，准确加入1.0 mL色谱级甲醇洗脱，流速为1 mL /min ～ 2 mL /min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，经 0.22 μm滤膜过滤，供 HPLC 分析用。
1.5 标准溶液的配制
将黄曲霉毒素B₁标准溶液依次稀释成 20.0 ng /mL，10.0 ng /mL，5.0 ng /mL，2.0 ng /mL，1.0 ng /mL，0.5 ng /mL，进样分析，以标准系列溶液的峰面积对浓度绘制黄曲霉毒素B₁的标准曲线。
2、结果与分析
2.1 标准曲线及检出限
在 1.3 所示的条件下对黄曲霉毒素 B₁ 标准系列进行测定，以标准系列的浓度对应峰面积制作标准曲线，在配制的浓度范围内，黄曲霉毒素 B₁ 具有良好的线性关系，线性方程为y=41252.5x-1282.07，相关系数 R² 为 1.0，方法检出限为 0.1 μg/kg。
2.2 准确度

样本名称	加标点（ng/g）	提取方式	回收率/%
普洱茶1	10	70%甲醇	24.0
		80%乙腈	84.0
		纯甲醇	70.2
普洱茶2	10	70%甲醇	36.6
		80%乙腈	85.6
		纯甲醇	66.0
普洱茶3	10	70%甲醇	41.0
		80%乙腈	86.7
		纯甲醇	71.0

本次随机选取三种普洱茶进行前处理方法的对比，数据显示，80%乙腈的提取效果最好，随后我司利用80%乙腈的方法将收集到的所有的普洱茶进行了黄曲霉毒素B₁的检测。
2.3 样本测定
本实验对市售的 23份普洱茶样品进行检测，样品中均未检出黄曲霉毒素 B₁。

序号	样本来源	样本名称	样本编号	AFB₁-HPLC（μg/kg）
1	延庆康庄华联超市	普洱茶50	PEC170911001	未检出
2	延庆康庄华联超市	普洱茶260	PEC170911002	未检出
3	云南	中茶公司近20年	PEC170911003	未检出
4		陈皮普洱5年以上	PEC170911004	未检出
5		普洱转十年以上	PEC170911005	未检出
6		普洱年代不详	PEC170911006	未检出
7		陈皮普洱年代不详	PEC170911007	未检出
8		老普洱散茶年代不详	PEC170911008	未检出
9		古树红茶	PEC170911009	未检出
10	延庆恒生市场	顶级普洱	PEC170911010	未检出
11		生茶	PEC170911011	未检出
12		普洱茶30-1	PEC170911012	未检出
13		普洱茶30-2小青柑	PEC170911013	未检出
14		普洱茶30-3小青柑	PEC170911014	未检出
15		普洱茶20	PEC170911015	未检出
16		普洱茶10-1香沱糯米	PEC170911016	未检出
17		普洱茶10-2普洱沱茶	PEC170911017	未检出
18	京东商城	普洱茶-梓瑞	PEC170911018	未检出
19		普洱茶-古树陈韵	PEC170911019	未检出
20		糯香普洱	PEC170911020	未检出
21		普洱茶-古树茶	PEC170911021	未检出
22		普洱茶-砖茶	PEC170911022	未检出
23		冰岛	PEC170911023	未检出

3、讨论
本实验室通过方法对比以保证样本检测结果的准确性，然后采用回收率最好的前处理方法对23份从不同地方收集到的普洱茶进行检测，均未检出黄曲霉毒素B₁（方法检出限为0.1μg/kg），且所收集到的样本均从正常渠道购买，均未出现发霉现象，由此可知市场上的普洱茶并非大量存在黄曲霉毒素污染的情况。本次普查的样本量还不够大，后期会继续增加样本的普查。
本实验室还在继续筛查普洱茶中呕吐毒素、玉米赤霉烯酮毒素、赭曲霉毒素A、T-2毒素以及伏马毒素的污染情况，后续会持续更新，敬请关注。