一个食品总砷的方法验证

一、概述
二、验证项目及限度
三、验证内容
一、概述
根据CNAS-CL10《检测和校准实验室能力认可准则在化学检测领域的应用说明》中5.4“检测和校准方法及方法的确认”的规定：“实验室应对试验方法的检出限、精密度、回收率、适用的浓度范围和样品基体等特性来对检测方法进行确认。实验室应能解释和说明检出限和报告限的获得。报告限应设定在一定置信度下可获得定量结果的水平。”，检验方法学的验证是保证检验结果准确可靠的关键因素。
《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》是2014年颁布的新标准，其第二法是用湿法消解法或干灰化法对食品中有机质消化，并加入多种试剂的前处理方法，用该法取得的消解溶液在原子荧光光度计上机，该方法中供试品溶液制备方法较为复杂，需要通过对《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定GB 5009.11-2014》中第二法中的氢化物发生原子荧光光谱法上机方法和湿法消解前处理方法进行《实验室质量控制规范 食品理化检测》GB/T 27404-2008中附录F 技术要求的检测方法确认，其包括：回收率、校准曲线、精密度、测定低限、定量限和报告限、准确度、提取效率等的确认，确保检验方法对被检物质有足够的专属性和灵敏度，通过重复性试验和回收率试验验证检验过程的回收率和重现性，并确定食品中砷的线性范围、定量限、检出限和报告限。
通过验证《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定GB 5009.11-2014》中第二法中的氢化物发生原子荧光光谱法上机方法和湿法消解前处理方法，来测定食品中砷的含量方法，用以确定该法在本实验室的适用性及可控性。
二、验证项目及限度
1.溶液配制
2.仪器工作条件
3.前处理
4.校准曲线
5.回收率
6.精密度
7.方法测定低限
8.准确度
三、验证内容
1．仪器与材料
1.1 样品：白术标准物质GBW09588、螺旋藻样品
1.2 方法选择：《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定GB 5009.11-2014》第二法中的氢化物发生原子荧光光谱法上机方法和湿法消解前处理方法。未选择12.2.2干灰化法作为试样消解的前处理方法。
1.3 仪器及试药:
1.3.1原子荧光光度计：
北京海光双道原子荧光光度计 AFS-9730，北京海光仪器有限公司。
1.3.2 量具
200μL移液器，报告时应记录厂家信息和校准证书编号。
1mL移液器，报告时应记录厂家信息和校准证书编号。
1000mL量筒，报告时应记录厂家信息和实验室编号。
100mL量筒，报告时应记录厂家信息和实验室编号。
2mL刻度吸管，报告时应记录厂家信息和实验室编号。
10mL刻度吸管，报告时应记录厂家信息和实验室编号。
15mL刻度吸管，报告时应记录厂家信息和实验室编号。
1.3.3试剂
氢氧化钾，分析纯，报告时应记录厂家和批号信息。
硼氢化钾，分析纯，报告时应记录厂家和批号信息。
氢氧化钠，分析纯，报告时应记录厂家和批号信息。
硼氢化钠，分析纯，报告时应记录厂家和批号信息。
硫脲，分析纯，报告时应记录厂家和批号信息。
抗坏血酸，分析纯，报告时应记录厂家和批号信息。
盐酸，优级纯，报告时应记录厂家和批号信息。
硝酸，优级纯，报告时应记录厂家和批号信息。
硫酸，优级纯，报告时应记录厂家和批号信息。
高氯酸，优级纯，报告时应记录厂家和批号信息。
砷单元素标准物质，报告时应记录厂家和批号信息。
1.3.4天平：电子天平（0.1mg），报告时应记录厂家信息和实验室编号。

1.4 试验方法
依据《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定GB 5009.11-2014》中第二法中的氢化物发生原子荧光光谱法上机方法和湿法消解前处理方法，具体内容如下：
1.4.1溶液配制：
1）硫酸溶液（1+9）：取90mL纯化水，沿瓶壁缓缓加入10mL浓硫酸，期间用冰块冷却，加入完毕后，缓缓摇匀，冷却即得。根据实验结果调整溶液配比。
2）硫脲+抗坏血酸溶液：取10g硫脲和10g抗坏血酸加入棕色容量瓶，加入70mL纯化水，稍微加热至60℃，溶解冷却，定容至刻度线即得。可根据实验结果调整溶液配比。
3）5%盐酸溶液：取1000mL量筒，加入50mL盐酸溶液，加入800mL纯化水，搅匀，加水至1000mL刻度线，即得。可根据实验结果调整溶液配比。
4）原子荧光还原剂：取14g硼氢化钠和2g氢氧化钠，倒入棕色玻璃瓶中，加入2L纯化水，溶解即得，注意保存时产生的氢气会挤压瓶子引起爆炸，要时时放气并远离火源。溶液有效期在本实验中判断，并可根据实验结果调整溶液配比。
方法中的原子荧光还原剂为硼氢化钾和氢氧化钾，但反应原理与硼氢化钠、氢氧化钠一致，为了节约实验室成本，使用硼氢化钠和氢氧化钠进行替代，并进行方法验证。

1.4.2原子荧光光度计工作条件

表1 预设仪器工作条件

实验参数暂定为表格中的参数，应在实验中验证或改进上述参数与配置。
1.4.3 前处理
根据GB 5009.11-2014《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》中12.2.1 湿法消解（本方法验证方案不采用干灰化法），前处理的实验步骤与国标一致，在验证过程中，应满足GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》附录F 检测方法确认的技术要求。

1.4.4 校准曲线
精密量取砷单元素标准物质溶液（1000μg/mL）0.1mL至100mL，用2%硝酸溶液稀释，此为砷对照品母液；精密量取砷对照品母液0、0.2mL、0.25mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL，移至25mL比色管（分别相当于砷浓度为0.0ng/mL、8ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL），各加硫酸溶液（1+9）12.5mL，硫脲+抗坏血酸溶液2mL，再加纯化水至刻度线，混匀后放置30min，即得砷的标准曲线溶液。可根据实验情况适当调整该校准曲线的浓度与范围，并进行方法学确认。测试溶液中的被测组分浓度应在校准曲线线性范围的回收率范围内。
应满足GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》附录F 检测方法确认的技术要求中F.2 校准曲线的要求：应描述校准曲线的数学方程以及校准曲线的工作范围，浓度尽可能覆盖一个数量级，至少作5个点（不包括空白）。对于确证方法，相关系数不应低于0.99，测试溶液中的被测组分浓度应在校准曲线的线性范围内。
1.4.5 回收率
采取全程空白加标法。在方法测定低限、常见限量指标、选一合适点进行三水平的加标试验。回收率参考范围依据GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》附录F 检测方法确认的技术要求中F.1 回收率的要求：

表2 回收率范围

1.4.6 精密度
分别精密吸取不同浓度的空白加标溶液各1.5mL，按测定方法重复进样6次，测定峰面积值。对各次测得的峰面积值求实验室内变异系数，变异系数应不得过《实验室质量控制规范 食品理化检测》GB/T 27404-2008中附录F 检测方法确认的技术要求中F.3 精密度的要求，用以说明方法精密度情况。变异系数的规定如下：

表3 实验室内变异系数

1.4.7 方法测定低限
根据《实验室质量控制规范 食品理化检测》GB/T 27404-2008中附录F 检测方法确认的要求，方法测定低限应当有这样三方面的要求：
（1）应当符合F.4 测定低限的要求，即方法的测定低限等于3倍空白值标准偏差除以方法校准曲线的斜率。
（2）回收率应在方法测定低限进行三水平试验，回收率的范围应满足表2的规定。
（3）应描述校准曲线的工作范围，并且测试溶液中的被测组分浓度应在校准曲线的线性范围内。
对于重金属和有害元素痕量实验，一般不能同时满足以上的三个条件，计算得到的方法测定低限是远低于校准曲线的工作范围的，且计算得到的方法测定低限的回收率不会满足标准要求，同时在低于校准曲线工作范围的情况下做回收率实验也是没有意义的，所以在这里采取折衷的办法，满足（2）和（3）的要求，对要求（1）用验证的思路，检查其本方法验证规定的方法测定低限是否大于计算得到的方法测定低限。
根据要求（3），测试溶液中的被测组分浓度应在校准曲线的线性范围内，这样可得实验室规定的方法测定低限应大于等于校准曲线的范围最低点。根据本方法验证方案的校准曲线的规定，将方法测定低限暂定为8ng/mL（溶液浓度），通过方法验证来证实。
1.4.8 准确度
根据《实验室质量控制规范 食品理化检测》GB/T 27404-2008中附录F 检测方法确认的要求，重复分析标准物质（白术，标准物质编号为GBW09588），测定含量平均值与真值的偏差范围应符合表4。

表4 测定值与真值的偏差指导范围

食品中砷含量测定的方法验证报告

一、 概述
二、 结果分析与结论
三、 结论

二、结果分析与结论

1．仪器与材料

1.1 样品：白术标准物质GBW09588、螺旋藻样品

1.2 方法选择：《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定GB 5009.11-2014》第二法中的氢化物发生原子荧光光谱法上机方法和湿法消解前处理方法。未选择12.2.2干灰化法作为试样消解的前处理方法。

1.3 仪器及试药:

1.3.1原子荧光光度计：

北京海光双道原子荧光光度计 AFS-9730，北京海光仪器有限公司。

1.3.2 量具

200μL移液器，编号：YYQ-03（YQS），赛多利斯

1mL移液器，编号：YYQ-04（YQS），赛多利斯

1000mL量筒，编号：LT-1000-007-YQ

100mL量筒，编号：LT-100-015-YQ

2mL刻度吸管，编号：K-2-010-YQ

10mL刻度吸管，编号：K-10-037-YQ

15mL刻度吸管，编号：K-15-004-YQ

1.3.3试剂

氢氧化钾，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20120910

硼氢化钾，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20141104

氢氧化钠，分析纯，天津瑞金特化学试剂有限公司，批号：20121008

硼氢化钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20140717

硫脲，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号；20131018

抗坏血酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20161011

盐酸，优级纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20121001

硝酸，优级纯，苏州晶瑞化学试剂有限公司，批号：151223827

硫酸，优级纯，重庆川东化工股份有限公司，批号：20151001

高氯酸，优级纯，国药集团股份有限公司，批号：20160615

砷单元素标准物质，中国计量科学研究院，批号：16052

1.3.4天平：电子天平（0.1mg），TZ-EB-01-A，赛多利斯

1.4 试验方法

依据《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定GB 5009.11-2014》中第二法中的氢化物发生原子荧光光谱法上机方法和湿法消解前处理方法，具体内容如下：

1.4.1溶液配制：

1）硫酸溶液（1+9）：取90mL纯化水，沿瓶壁缓缓加入10mL浓硫酸，期间用冰块冷却，加入完毕后，缓缓摇匀，冷却即得。

2）硫脲+抗坏血酸溶液：取10g硫脲和10g抗坏血酸加入棕色容量瓶，加入70mL纯化水，稍微加热至60℃，溶解冷却，定容至刻度线即得。

3）5%盐酸溶液：取1000mL量筒，加入50mL盐酸溶液，加入800mL纯化水，搅匀，加水至1000mL刻度线，即得。

4）原子荧光还原剂：取14g硼氢化钠和2g氢氧化钠，倒入棕色玻璃瓶中，加入2L纯化水，溶解即得，注意保存时产生的氢气会挤压瓶子引起爆炸，要时时放气并远离火源。

原方法中的原子荧光还原剂为硼氢化钾和氢氧化钾，但反应原理与硼氢化钠、氢氧化钠一致，为节约实验室成本，使用硼氢化钠和氢氧化钠进行替代。

1.4.2原子荧光光度计工作条件

表1 仪器工作条件

实验中确定原子荧光光度计工作条件为上述条件。

1.4.3 前处理

根据GB 5009.11-2014《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》中12.2.1 湿法消解（本方法验证不采用干灰化法），前处理的实验步骤与国标一致。

1.4.4 校准曲线

精密量取砷单元素标准物质溶液（1000μg/mL）0.1mL至100mL，用2%硝酸溶液稀释，此为砷对照品母液；精密量取砷对照品母液0、0.15mL、0.25mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL，移至25mL比色管（分别相当于砷浓度为0.0ng/mL、6ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL），各加硫酸溶液（1+9）12.5mL，硫脲+抗坏血酸溶液2mL，再加纯化水至刻度线，混匀后放置30min，即得砷的标准曲线溶液。

此标准曲线配制方法与方案制定时有所差异。主要原因为：（1）经过实验，发现8~80ng/mL的线性范围，会在最高点80ng/mL时有所偏离，2017-02-17所做的8~80ng/mL的相关系数为0.9994，而2017-02-24之后所做的6~60ng/mL范围的相关系数为0.9998以上。虽然0.9994的相关系数符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》附录F 检测方法确认的技术要求中F.2 校准曲线的要求，但因为80ng/mL的点经常偏离会导致回收率有所偏离，且一般样品浓度并不会用到80ng/mL的范围。综上所述，实验中将线性调整为0.0ng/mL、6ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL。

表2 原子荧光校准曲线（数据来源于2017-2-24）

图1 校准曲线

标准点6ng/mL所在的样品浓度为0.15mg/kg（样品称样量为1g计算得到），根据验证方案表2可知，被测组分含量0.1~1mg/kg的回收率为80~110%，可知6ng/mL的允许回收最低为4.8ng/mL。
标准点60ng/mL所在的样品浓度位1.5mg/kg（样品称样量为1g计算得到），根据验证方案表2可知，被测组分含量1~100mg/kg的回收率为90~110%，可知60ng/mL的允许回收最高为66ng/mL。
故可知，食品砷含量测定的校准曲线为6~60ng/mL，其线性范围是4.8~66ng/mL（以称样量为1g计）。
满足GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》附录F 检测方法确认的技术要求中F.2 校准曲线的要求：1、描述校准曲线的数学方程以及校准曲线的工作范围；2、浓度尽可能覆盖一个数量级；3、至少作5个点（不包括空白）；4、对于确证方法，相关系数不应低于0.99。
1.4.5 回收率
采取全程空白加标法。在方法测定低限、常见限量指标、选一合适点进行三水平的加标试验。因为曾经使用过8~80ng/mL的线性，因此方法测定低限曾经使用过8ng/mL，也有8ng/mL的空白加标回收率，在此一并列出。
下列空白加标以加标1为8ng/mL，加标2为20ng/mL，加标3为40ng/mL，加标回收率如下：

表3 三水平三平行加标回收（数据来源于2017-2-17，单位为ng/mL）

下列空白加标以加标1为6ng/mL，加标回收率如下：

表4 一水平三平行加标回收（数据来源于2017-3-4，单位为ng/mL）

回收率依据GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》附录F 检测方法确认的技术要求中F.1 回收率的要求：

表5 回收率范围

所测空白加标回收率均大于95%并小于105%，符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》附录F 检测方法确认的技术要求中F.1 回收率的要求。

1.4.6 精密度
分别精密吸取不同浓度的空白加标溶液一瓶，按测定方法重复进样6次，测定峰面积值，并计算变异系数。

表6 精密度数据

（数据来源于2017-2-17、2017-3-4和2017-2-25，单位为ng/mL）

对各次测得的峰面积值求实验室内变异系数，变异系数符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》GB/T 27404-2008中附录F 检测方法确认的技术要求中F.3 精密度的要求，变异系数的规定如下：

表7 实验室内变异系数

1.4.7 方法测定低限
根据《实验室质量控制规范 食品理化检测》GB/T 27404-2008中附录F 检测方法确认的要求，方法测定低限应当有这样三方面的要求：
（1）应当符合F.4 测定低限的要求，即方法的测定低限等于3倍空白值标准偏差除以方法校准曲线的斜率。
（2）回收率应在方法测定低限进行三水平试验，回收率的范围应满足表2的规定。
（3）应描述校准曲线的工作范围，并且测试溶液中的被测组分浓度应在校准曲线的线性范围内。
对于重金属和有害元素痕量实验，一般不能同时满足以上的三个条件，计算得到的方法测定低限是远低于校准曲线的工作范围的，且计算得到的方法测定低限的回收率不会满足标准要求，同时在低于校准曲线工作范围的情况下做回收率实验也是没有意义的，所以在这里采取折衷的办法，满足（2）和（3）的要求，对要求（1）用验证的思路，检查其本方法验证规定的方法测定低限是否大于计算得到的方法测定低限。
根据要求（3），测试溶液中的被测组分浓度应在校准曲线的线性范围内，这样可得实验室规定的方法测定低限应大于等于校准曲线的范围最低点。根据前述方法验证报告可知，将方法的最低线性为6ng/mL（溶液浓度），方法测定低限即为6ng/mL（计算为以1g计为0.150mg/kg），计算出的方法测定低限以“方法检出限”表达。同时，上述得到的方法测定低限根据CNAS-CL10:2012表述，也可以定义为方法报告限。下面通过计算来证实。

表8 由11个空白计算得到的检出限与方法测定低限对比（数据来源于2017-2-17）

表9 由20个空白计算得到的检出限与方法测定低限对比（数据来源于2017-3-10）

计算出两个不同数值的方法检出限取较大数值，即，该方法的方法检出限为0.005mg/kg；方法测定低限为0.150mg/kg（同时该浓度也为方法报告限）。

1.4.8 准确度
根据《实验室质量控制规范 食品理化检测》GB/T 27404-2008中附录F 检测方法确认的要求，重复分析标准物质（白术，标准物质编号为GBW09588）。

表10 白术标准物质计算数值（测定浓度的单位为ng/mL）

此数据未进行回收率校准。
测定含量平均值与真值的偏差范围符合表11。

表11 测定值与真值的偏差指导范围

三、结论
通过对《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定GB 5009.11-2014》中第二法中的氢化物发生原子荧光光谱法上机方法和湿法消解前处理方法进行《实验室质量控制规范 食品理化检测》GB/T 27404-2008中附录F 技术要求的检测方法确认，其包括：回收率、校准曲线、精密度、测定低限、检出限、报告限、准确度等的确认。
从以上数据可以看出用该方法检测食品中总砷的含量，结果准确可靠，可以在本实验室运用此方法。
该方法中总砷的方法检出限为0.005mg/kg，方法测定低限为0.150mg/kg，方法报告限为0.150mg/kg，线性范围为4.8~66ng/mL。

测定低限和定量限是什么关系呀，老师。

根据《实验室质量控制规范 食品理化检测》GB/T 27404-2008中附录F 检测方法确认的要求，方法测定低限应当有这样三方面的要求：
（1）应当符合F.4 测定低限的要求，即方法的测定低限等于3倍空白值标准偏差除以方法校准曲线的斜率。
（2）回收率应在方法测定低限进行三水平试验，回收率的范围应满足表2的规定。
（3）应描述校准曲线的工作范围，并且测试溶液中的被测组分浓度应在校准曲线的线性范围内。
在GB27404上，没有找到定量限的描述。我同时也是做药品的，药品的定量限是10倍标准偏差，同时还要验证回收率和重现性。
但我这篇东西的方法测定低限没能按照3倍标准偏差计算，因为不满足其他两个要求。

学习了