富硒木耳中的硒元素形态分析
张俊杰
山西大学,大型科学仪器中心，山西太原，030006
摘要：硒元素因具有抗氧化及防癌功效，对人类健康起关键作用，农产品及食品的富硒化培养及富硒效果评价，是近年来的研究热点。电感耦合等离子体质谱具有高灵敏度和高稳定性，在硒元素的检测方面具有一定优势。本论文使用电感耦合等离子体质谱，以富硒木耳为研究对象,通过液相色谱偶联电感耦合等离子体质谱，比较了不同提取方法对富硒木耳小分子硒形态的提取效率,对木耳的硒形态进行了定量分析。结果表明,以胃蛋白酶孵育提取，可对富硒木耳的硒形态达到较好的提取，且硒代蛋氨酸是富硒木耳硒的主要形态。
关键词：电感耦合等离子体质谱、富硒木耳、硒形态
引言
硒（Selenium, Se）是人类和动物生命中所必需的微量元素。人体和动物对硒的反应较敏感，硒摄入过量或者不足均易引发疾病，如硒过剩可引起生殖力下降或者高畸胎率，甚至导致癌症；而硒缺乏可加速机体衰老，导致心血管疾病等40多种流行性的地方病 。
人体所需要的硒主要来自于食物，在吸收利用率及安全性方面，植物性硒源高于动物性硒源，有机硒高于无机硒。植物体内的硒有无机、有机和挥发3种形态，主要以有机硒为主，挥发态硒仅占植物硒量的5%，无机硒约占全硒量的15%，并以Se（Ⅳ）形式存在。有机硒由包括大分子的硒蛋白、硒核酸及硒多糖和以硒代氨基酸及其衍生物形式存在的小分子硒化物组成。目前已经证明的食品中含有的硒化合物有20多种，常见的有硒酸根(SeO42-)、亚硒酸根(SeO32-)、硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(Se（Cys）2)、硒脲(SeUr)、硒代乙硫氨酸(SeEt)等。
目前国内外报到的硒元素的研究主要包括生物、环境、地质、食品中硒元素总量测定，硒形态测定及富硒植物栽培及富硒效果研究。HPLC-ICP-MS,是分析硒化合物应用最多的方法之一，但还存在诸多需要解决的问题：如硒形态的不稳定,造成其无法准确地定性定量，植物硒形态化合物种类繁多,且含量低,但标准品有限,造成目标化合物的不可知性 。针对这些问题，在硒形态的分析方面，需要注意对复杂样品采集后，进行妥善储存，如分析前应该用冷冻干燥处理样品，而非高温烘干，避免硒形态发生变化；使用合适的提取条件，确保预处理条件的稳定可靠性，对硒形态进行准确提取；另外，开发有效方法，如植物硒标准品的制备，利用电喷雾质谱(ESI-MS)，电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)以及二维凝胶色谱分离结合激光解吸飞行质谱(MALDI-TOF)等新技术，进一步鉴定未知硒形态化合物的结构 。
本文立足于富硒木耳中小分子硒形态测定的目的，优化硒形态提取条件，以期得到一种快速、稳定可靠的小分子硒形态的分析方法。
1材料与方法
1.1 实验材料
富硒的木耳样品收获干燥后，用搅拌机碎成粉末，过60目筛待用。
1.2 试剂药品
实验所需药品包括:甲醇（西陇化工股份有限公司），乙酸铵（分析纯）（天津市天力化学试剂有限公司，中国），胃蛋白酶Pepsin1:3000，Amresco: 0685(sigma，美国)，柠檬酸（天津博迪化工股份有限公司，中国），12 mol/L浓盐酸，浓硝酸（65%-68%，优级纯）（国药集团化学试剂有限公司，中国上海），磷酸氢二铵（分析纯）（天津市天力化学试剂有限公司，中国），甲酸（分析纯）（天津市天力化学试剂有限公司，中国），硒形态标准溶液（六价硒Se6+，四价硒Se4+，硒代胱氨酸Se(cys)2，硒代蛋氨酸（SeMet）（国家有色金属及材料研究中心，中国）。超纯水（电阻率≥18MΩ·cm）采用EASY15 Heal Force超纯水系统(力康发展有限公司，香港)制备。
1.3 实验仪器
电感耦合等离子体质谱仪（PerkinElmer，美国），Flexa超高效液相色谱仪（PerkinElmer，美国），Ex2250ZH电子天平（奥豪斯仪器，中国常州），雷磁pH计及pH计校准溶液（上海仪电科学仪器股份有限公司，中国）。
1.4 样品前处理
称取0.2g左右的木耳样品粉末（精确至0.1mg），分别加入1 g/L胃蛋白酶溶液、25 mmol/L乙酸铵、5 mmol/L柠檬酸、0.1 mol/L稀盐酸、70℃热水和1:1（v:v）的甲醇：水溶液10 mL，记为A、B、C、D、E、F组。样品A置于37℃下孵育过夜，其他样品室温下超声提取1小时，提取完成后，将悬浮液进行15000 rpm高速离心10 min，取上清测试。
1.5 仪器参数
采用阴离子交换柱（anion- exchange column(Hamilton PRP-X100)）（4×250mm, 10 μm）进行液相分离，流动相为60mM磷酸氢二铵（(NH4)2HPO3），用甲酸调节pH至6.0，流速为1 mL/min；等度洗脱，洗脱时间为15 min。
ICP-MS参数设置：功率：1600W，等离子体氩气流速：18L/min，辅助气流速1.2L/min，载气流速0.94 L/min，雾化器类型Meinhard，滞留时间50 ms，仪器调谐指标如常规分析灵敏度指标Be（9）：>2000 cps，In（115）：>40000 cps，U(238):>30000 cps；背景：Bkgd220≤1 cps ，氧化物比值（CeO+156/Ce+140）:≤2.5%，双电荷离子比值（Ce2+70/Ce+140）：≤3.0%，质量数和分辨率Li(7.016)，Mg(23.985)，In(114.904)和U(238.05)在10%峰高处的峰宽在0.65-0.8 amu范围内。实验前，优化矩管位置、雾化器流量，四极杆离子偏转器（QID）电压及检测器电压，并进行检测器双模校正。在DRC模式下，80Se干扰最小，且响应最高，选用此同位素进行硒的测定。
1.6 数据处理
根据硒形态标准品的出峰时间，对木耳样品的硒形态进行定性。根据硒形态标准品浓度及色谱峰面积响应，以浓度为横坐标，色谱峰面积响应为纵坐标，做线性标准曲线，计算回归方程。从回归方程中计算木耳样品相应硒形态的浓度。
2 实验结果
2.1 硒形态的HPLC-ICP-MS检测方法建立
建立了基于HPLC-ICP-MS的对木耳硒形态进行形态分离及检测的方法，四种硒形态标准品包括硒代胱氨酸Se(cys)2、亚硒酸钠Se4+、硒代蛋氨酸SeMet和硒酸钠Se6+，在此方法条件下可以达到良好的分离，其色谱图如图1所示。根据系列稀释得到四个浓度的硒形态混合标准溶液，其响应和线性校正方程如表1所示。
图1 硒形态检测的HPLC-ICP-MS色谱图
Fig. 1 Chromatography of selimium species using HPLC-ICP-MS
表1 HPLC-ICP-MS硒形态分析的线性响应及线性方程
Table 1 Linear of selimium species detection using HPLC-ICP-MS
| 硒形态 | 项目 | 浓度1 | 浓度2 | 浓度3 | 浓度4 |
| Se(cys)2 | 响应 | 17818.2 | 41345.6 | 83142.3 | 226466.1 |
| 标准曲线 | y = 2120x - 16400 |
| Se4+ | 响应 | 32047.2 | 67445.4 | 144565.1 | 283230.5 |
| 标准曲线 | y = 2630x + 1350 |
| SeMet | 响应 | 10487.0 | 50663.8 | 101388.9 | 243290.9 |
| 标准曲线 | y = 2610x - 17400 |
| Se6+ | 响应 | 37873.0 | 91726.0 | 189795.9 | 281521.9 |
| 标准曲线 | y = 2590x + 26200 |
2.2 木耳硒形态的提取方法优化
以硒形态提取的种类及浓度为指标，比较了不同提取方式，包括胃蛋白酶、25 mmol/L乙酸铵、5 mmol/L柠檬酸、0.1 mol/L稀盐酸、70℃热水和1：1（v/v）的甲醇和水溶液对富硒木耳硒形态的提取效率，结果如图2所示。
参照硒形态标准品的保留时间，样品中硒形态出峰如图2所示，物质1、2、3分别为Se(cys)2：Se4+和SeMet，其余硒形态由于缺少标准品，未知，标记为U。可以看出，SeMet在富硒木耳样品中浓度最高，其他形态，包括Se(cys)2和Se4+含量很低，不存在Se6+形态。几种提取方式比较，胃蛋白酶的提取效果最好，响应值最高，乙酸铵提取效果总体上不如胃蛋白酶。柠檬酸和稀盐酸对已知硒形态形态的提取效果相差不大，热水提取效果最差，1：1（v/v）的甲醇水溶液和0.1 mol/L的稀盐酸提取物中，出现了未知硒形态，有待进一步对其进行定性研究。
2.3 木耳硒形态含量分析
根据标准曲线，计算得出样品中硒形态形态的浓度结果。经过胃蛋白酶提取，木耳硒形态浓度分别为Se(cys)2 23.18μg/L，Se4+ 4.17μg/L， SeMet 205.04μg/L，浓度折合计算成样品中干重为Se(cys)2 1.159μg/g，Se4+ 0.208μg/g， SeMet 10.252μg/g，不存在六价硒形态。已知硒形态占到总硒浓度（22.89μg/g）的44.79%。 
图2 不同提取方法对木耳硒形态的提取效率，(A) 1g/L胃蛋白酶溶液；(B)25 mmol/L乙酸铵溶液；(C) 5mmol/L柠檬酸；(D) 0.1mol/L稀盐酸；(E) 70℃热水；(F)1：1（v/v）的甲醇水溶液
(1, Se(cys)2, 2, Se4+,3, SeMet, U, unknown)
Fig. 2 Comparation of selimium species extraction efficiency ofdifferent extraction methods (A) 1 g / L pepsin solution; (B) 25 mmol / Lammonium acetate solution; (C) 5 mmol / L citric acid; (D) 0.1 mol / Lhydrochloric acid; (E) hotwater; (F) 1：1 (v: v) methanol: water
3 结论
本论文使用电感耦合等离子体质谱，以富硒木耳为研究对象，通过液相色谱偶联电感耦合等离子体质谱，比较了不同提取方法对富硒木耳硒形态的提取效率，对硒形态进行了定量分析；结果表明，以胃蛋白酶孵育提取，可对富硒木耳的硒形态达到较好的提取，且硒代蛋氨酸是富硒木耳的主要形态。致 谢
感谢中国农业大学提供的富硒木耳样品。
参考文献
李金峰等﹒土壤—植物系统中硒营养的研究进展﹒南方农业学报﹒2016，5：649-656
许凌凌﹒植物硒的研究进展﹒安徽农学通报﹒2016，12：14-16
程建中, 杨萍,桂仁意﹒植物硒形态分析的研究综述﹒浙江农林大学学报﹒2012，29(2):288-295
Vonderheide A. P., Wrobel K., Kannamkumarath S.S., B'Hymer C.,Montes-Bayón M., Ponce De León C., Caruso J. A﹒Characterization of SeleniumSpecies in Brazil Nuts by HPLC-ICP-MS and ESI-MS. J. Agric. Food Chem﹒2002，50，5722-5728
Infante H. G. , Borrego A. A., Peachey E., Hearn R., Connor G. O.,Barrera T. G., Ariza J-L. G.﹒Study of the Effect of Sample Preparation and Cooking on the SeleniumSpeciation of Selenized Potatoes by HPLC with ICP-MS and ElectrosprayIonization MS/MS. J. Agric. Food Chem﹒2009，57，38-45
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