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【前处理】不同溶剂液液萃取橙汁饮料挥发性香气对比分析

symmacros

2018/09/26
分析者端木精英队

私聊

分离/萃取

前言
橙汁饮料是一种添加一定量的天然橙汁、香料、甜味和酸味剂等成分制成的饮料。是最常见最受大家欢迎的饮品之一，味道可口，有一定的营养价值。但橙汁饮料的香气成分很复杂，香气化合物的极性相差较大，沸点范围很宽，所涵盖的化合物这类很多。也无法直接进样，需要进行适当的提取后供gc-MS分析。本文采用液液萃取--气相色谱质谱法分析橙味饮料里面挥发性香气组分，对比两种不同溶剂提取效果；利用Amdis质谱解卷积软件识别拆分共流出色谱峰，得到更纯净的质谱图，更利于下一步质谱检索的工作；并结合保留指数校正使质谱检索结果更为准确。并使用动态范围宽的FID内标法定量。
1试验部分
1.1 仪器与装置
安捷伦6890N/5973I气相色谱-质谱联用仪，带FID检测器，一根毛细管柱通过分流进入MS和FID。
液液萃取分液漏斗，K-D浓缩器。
1.2样品
样品：橙汁饮料，样品购于某超市。
乙醚，正戊烷和二氯甲烷均为色谱纯。氯化钠为分析纯。香气化合物标准品均来自Sigma-Aldrich等主要试剂公司，少数为原料精制标样。C6-C30正构烷混合标准物来自安谱。
1.3 gc/MS条件

1.3.1 色谱条件:
色谱柱：安捷伦HP-Innowax(60m×0. 25 mm ( i.d.)×0.25μm)毛细管柱
升温程序： 60℃，以3 ℃/min升至250℃，保持28 min；
载气：He, 纯度99.999%以上，流速1.8 mL/min;
进样口温度250℃，分流进样，分流比10:1; 进样量：1μl。
检测器：FID，氢气：30ml/min, 空气：350ml/min, 尾吹：N2，30ml/min, 温度：270℃。
1.3.2质谱条件:
电子轰击（EI）离子源；电子能量70eV；传输线温度250℃；离子源温度230℃；四级杆温度150℃。SCAN扫描范围：29-400。EMV：1498V。溶剂延迟3.6min（乙醚戊烷萃取溶剂）和4.8min（二氯甲烷萃取溶剂）
1.4样品处理及分析方法
液液萃取法（LLE）：准确称取约300g橙汁饮料样品，加入适当量内标物，加入30g固体氯化钠，用乙醚戊烷（1:1）或二氯乙烷40mlX4提取后，无水Na2SO4干燥后用K-D浓缩器浓缩到1ml。进样1微升进行gc-MS/FID分析。
在分析样品前，和样品分析完全相同的条件下，用0.05%的C6-C30的正构烷标样注射到gcMS，获得正构烷的保留时间，用于计算保留指数。分析样品后，用软件计算样品各个组分的保留指数，并和标样的保留指数对比来，结合质谱来定性。事先也用同样方法测定标样的保留指数备用。
2 结果与讨论
2.1 橙汁饮料液液萃取挥发性香气总离子色谱图（TIC）
两种溶剂液液萃取橙汁饮料挥发性香气LLE总离子色谱图（TIC）如下：

图1. 两种溶剂液液萃取橙汁饮料挥发性香气LLE总离子色谱图
*****************************************************
从上面图可以看到，乙醚戊烷（1:1）和二氯甲烷提取的色谱图的轮廓（profile）基本一致，但个别地方的峰有所不同。由于两种溶剂出峰时间不一样而使用不同的溶剂延迟时间，乙醚戊烷提取的色谱图可以看到4.8min前部分的组分，而二氯甲烷只能看到4.8min后的组分。如下图放大前20min的色谱图，更为明显。

图2. 两种溶剂液液萃取橙汁饮料挥发性香气LLE前20分钟总离子色谱图（TIC）
****************************************************************
对前10min色谱图标注

图3. 两种溶剂液液萃取橙汁饮料挥发性香气LLE前10分钟标注的总离子色谱图
**************************************************
从上面标注的色谱图看出，用乙醚：戊烷（1:1）提取可以看到乙酸乙酯，乙缩醛，乙醇，2-butanone，2-methyl-TH-furan，丙酮，甲酸乙酯，甲基环己烷等。而二氯甲烷由于溶剂延迟晚而无法看到。
2.2数据处理：
先用Amdis质谱数据解卷积处理质谱数据，减少本底干扰，对共流出峰拆分，提取出大峰下面的峰或隐藏在里面的色谱峰。例如No.36-37: 20.31min, alpha-Copaene和Octanal；No.46-47, 24.095min, 4-terpinenol和caryophylene，No.66-67, 28.329, Germacrene D 和aldehyde C12等未分离合峰的解卷积拆分。同时用Amdis的MSL质谱数据库和工作站的PBM（L）质谱数据库检索，并结合保留指数来鉴定峰。所有保留指数均由标准样品测定。极少数没有保留指数的化合物，参照其它资料和以往的经验，在保证良好匹配度的情况下确认。由于FID的动态线性范围很宽，定量结果稳定，复杂的多挥发性组分一般用气相色谱FID来定量，而不用质谱总离子(TIC)来定量。用FID检测器的结果加校正因子计算香料香气挥发性组分的含量。
计算公式：
Ci =( Ai/As)*Cs*Fi/s
Ci为香气组分浓度（mg/kg）
Ai为香气组分峰面积
As为内标物的峰面积
CS为加入到样品的浓度（mg/kg）
Fi/s为组分i相对内标物的相对校正因子。
2.3 橙汁饮料香料香气挥发性成分

表橙汁饮料挥发性香料香气成分表

Concentration

P & E

CH2Cl2

NO.

(min)

Component Name

4.199

FURAN, 2-METHYL,TH-

0.022

0.000

4.248

ETHYL ACETATE

1.480

0.000

4.288

ACETALDEHYDE DIETHYL ACETAL

0.171

0.000

4.549

ALCOHOL

6.420

0.000

4.84

ETHYL PROPIONATE

0.035

0.000

5.86

PINENE, ALPHA-

0.268

0.270

5.96

ETHYL BUTYRATE

1.597

2.010

6.617

CAMPHENE

0.013

0.004

6.803

ALDEHYDE C 6

0.000

0.011

7.464

LIMETOL

0.000

0.007

8.385

CARENE, DELTA-3-

0.072

0.052

8.672

MYRCENE

2.003

1.514

8.81

PHELLANDRENE ALPHA

0.092

0.078

9.198

TERPINENE, ALPHA-

0.000

0.030

9.449

HEPTADIENAL, 2,5,6-TRIMETHYL-2,4-

0.017

0.000

9.565

ISOAMYL ALCOHOL

0.000

0.015

10.074

LIMONENE

121.651

86.729

10.174

PHELLANDRENE BETA

0.160

0.120

10.283

MENTHATRIENE, 1,5,8-P-

0.015

0.008

11.134

TERPINENE, GAMMA-

0.379

0.063

11.265

MENTHATRIENE, 1(7),2,8-P-

0.046

0.027

11.916

CYMENE, P-

0.028

0.017

12.17

ACETYL METHYL CARBINOL

0.000

0.026

12.326

TERPINOLENE

0.145

0.085

12.513

ALDEHYDE C 8

0.423

0.323

13.117

NONATRIENE, 4,8-DIMETHYL-1,3E,7-

0.000

0.007

13.246

METHYL BUTENOL-3,2

0.000

0.024

15.359

ALLYL CAPRONATE

0.053

0.036

16.264

ALDEHYDE C 9

0.074

0.051

17.838

DIMETHYLSTYRENE, P-

0.026

0.008

18.316

ALCOHOL C 7

0.000

0.012

18.612

FURFURAL

0.085

0.323

18.867

CUBEBENE, ALPHA-

0.000

0.038

19.372

OCTYL ACETATE, 1-

0.072

0.035

19.699

ISOOCTANOL

0.013

0.000

20.31

COPAENE, ALPHA-

0.018

0.090

20.31

ALDEHYDE C10

0.579

0.274

21.991

LINALOOL

1.533

1.152

22.313

ALCOHOL C 8

0.301

0.198

22.595

Menthenol-(1), 2-p-, trans-

0.000

0.040

22.609

MENTHEN-1-OL, E-2-P-

0.061

0.000

22.949

Acetaldehyd-3,8-p-menthandiolacetal

0.121

0.032

23.329

FENCHOL

0.059

0.039

23.869

ELEMENE, BETA-

0.000

0.054

23.956

CUBEBENE, BETA-

0.022

0.054

24.095

TERPINENOL, 4-

0.478

0.364

24.095

CARYOPHYLLENE

0.000

0.040

24.383

MYRCENOL

0.064

0.039

24.626

BICYCLO(3.2.1)OCTEN-6-ONE, CIS-4,7-DIMETHYL-3-

0.020

0.013

24.864

CYCLOCITRAL, BETA-

0.000

0.019

25.004

MENTHADIEN-1-OL, E-2,8-P-

0.000

0.069

25.013

BUTYRIC ACID

0.140

0.000

25.138

TERPINEOL, BETA-TRANS-

0.754

0.596

25.489

MENTHOL

0.029

0.015

25.654

METHYL 3-HYDROXYHEXANOATE

0.000

0.004

25.949

ALLOAROMADENDRENE

0.000

0.007

26.216

ALCOHOL C 9

0.037

0.030

26.486

CITRONELLYL ACETATE

0.013

0.012

26.571

MENTHADIEN-1-OL, Z-2,8-P-

0.029

0.024

26.722

FARNESENE, E-BETA-

0.000

0.016

26.928

ETHYL HYDROXYHEXANOATE-3-

0.000

0.062

27.004

TERPINEOL, BETA-CIS-

0.165

0.138

27.2

MENTHADIEN-4-OL, 1,8-P-

0.044

0.035

27.486

IONENE

0.017

0.000

27.657

TERPINEOL, ALPHA-

5.404

4.301

28.329

germacrene d

0.000

0.008

28.329

ALDEHYDE C12

0.075

0.044

28.622

VALENCENE

0.195

0.277

28.836

SELINENE, ALPHA-

0.029

0.047

28.846

MUUROLENE, ALPHA-

0.033

0.000

29.004

CARVONE

0.147

0.098

29.325

PIPERITOL, E-

0.037

0.024

29.435

PIPERITENOL, TRANS-ISO-

0.018

0.011

29.61

PIPERITENOL, CIS-ISO-

0.040

0.031

29.739

FARNESENE, 3E,6E-ALPHA-

0.000

0.020

29.925

GERANYL ACETATE

0.024

0.000

30.005

CADINENE, DELTA

0.123

0.145

30.086

CITRONELLOL

0.081

0.062

30.207

7-epi-.alpha.-selinene

0.022

0.019

30.624

MENTHADIEN-8-OL, 1(7),2-P-

0.029

0.017

30.826

PERILLA ALDEHYDE

0.210

0.126

31.16

MENTHADIEN-2-OL, TRANS-1(7),8-P-

0.040

0.015

31.285

NEROL

0.064

0.047

31.581

PHENYLETHYL ALCOHOL, 1-

0.015

0.012

31.815

nerol isomer

0.000

31.85

ISONEROL

0.013

0.000

32.482

CARVEOL L TRANS

0.090

0.065

32.71

CALAMENENE, TRANS-

0.000

0.001

32.71

PIPERITENONE, ISO-

0.022

0.019

32.926

GERANIOL

0.252

0.163

32.926

CYMENOL, 8-P-

0.000

0.017

33.103

Butoxyethoxyethyl acetate

0.000

0.007

33.233

IONONE, ALPHA-

0.009

0.000

33.424

MENTHADIEN-9-YL ACETATE, 1,8(10)-P-

0.037

0.016

33.539

CARVEOL L CIS

0.035

0.022

33.645

NERYL BUTYRATE

0.000

34.313

MENTHADIEN-2-OL, CIS-1(7),8-P-

0.020

0.012

34.833

GERANYL BUTYRATE

0.000

0.003

34.972

PHENYLETHYL ALCOHOL, 2-

0.000

0.001

100

35.529

PIPERITENONE

0.017

0.012

101

35.912

MENTHEN-9-OL PARA I

0.000

0.001

102

36.209

IONONE, BETA-

0.024

0.016

103

37.276

LINALOOL, 7-HYDROXY-6,7-DIHYDRO-

0.029

0.089

104

37.672

PYRONE, 3-HYDROXY-2-

0.110

0.886

105

37.908

MENTHADIEN-9-OL, 1,8(10)-P- I

0.108

0.086

106

38.188

MENTHADIEN-9-OL, 1,8(10)-P- II

0.013

0.007

107

38.537

EUGENOL METHYL ETHER

0.000

0.003

108

38.844

CARVONE, 1-HYDROXY-1,6-DIHYDRO-

0.013

0.000

109

39.632

NEROLIDOL, TRANS-

0.000

110

40.164

CAPRYLIC ACID

0.077

0.051

111

40.407

CUBENOL, 1,10-DIEPI-

0.015

0.000

112

40.822

ELEMOL

0.040

0.027

113

41.116

MENTHANEDIOL, CIS-1,8-P-

0.024

0.110

114

41.239

MENTHOL, 8-HYDROXY, NEO-

0.026

115

41.48

CYCLOHEXADIENONE, 2,6-DITERT.-BUTYL-4-HYDROXY-4-METHYL-2,5-

0.017

0.000

116

41.863

MENTHENE-1,8-DIOL, TRANS-2-P-

0.000

0.023

117

42.97

Alloisolongifolen

0.020

0.000

118

43.854

THYMOL

0.048

0.019

119

44.126

MUUROLOL, T-

0.048

0.024

120

45.196

DOCOSANE

0.000

0.050

121

45.475

SINENSAL, 2E,6E-BETA-

0.118

0.058

122

45.844

MENTHENE-1,2-DIOL-8-P-

0.046

0.035

123

46.291

GAMMA UNDECALACTONE

0.024

0.015

124

46.41

MENTHENE-1,2-DIOL-8-P-

0.000

0.069

125

46.819

Docosane isomer

0.000

0.215

126

46.837

CAPRIC ACID

0.031

0.000

127

47.464

MENTHANEDIOL, 2,8-P- II

0.000

0.020

128

48.201

TRICOSANE

0.000

0.298

129

48.439

SINENSAL, 2E,6E,9E-ALPHA-

0.048

0.026

130

50.166

DOCOSANE isomer

0.000

0.114

131

51.07

TETRACOSANE

0.000

0.114

132

51.399

CASCARILLIC ACID, CIS-

0.046

0.038

133

51.83

ABALYN (MAIN PEAK)

0.000

0.030

134

51.996

ABALYN D-E

0.017

0.034

135

52.388

ABALYN (MAIN PEAK)

0.000

0.036

136

52.569

N-DOCOSANE isomer

0.000

0.288

137

52.569

HYDROXYMETHYLFURFURALE, 5-

0.000

0.042

138

52.818

METHYL LINOLEATE

0.000

0.102

139

52.826

LAURIC ACID

0.094

0.000

140

52.992

ETHYL OLEATE

0.051

0.000

141

53.538

NOOTKATONE

0.085

0.054

142

53.859

PENTACOSANE

0.000

0.261

143

55.279

Tricosane isomer

0.000

0.016

144

55.695

Tetracosan isomer

0.000

0.099

145

56.526

HEXACOSANE

0.000

0.032

146

57.903

Tetracosane isomer

0.000

0.058

147

58.434

MYRISTIC ACID

0.051

0.031

148

58.908

Cryptomeridiol ?

0.000

0.019

149

59.109

HEPTACOSANE

0.000

0.046

150

61.083

PENTADECANOIC ACID

0.000

0.023

151

63.636

PALMITIC ACID

1.011

5.170

152

64.528

9-Hexadecenoic acid

0.000

0.130

153

67.71

ABALYN D-E

0.000

0.206

154

70.818

OLEIC ACID isomer

0.000

0.090

155

71.028

OLEIC ACID

0.461

2.205

156

72.818

LINOLIC ACID

0.505

2.608

SUM

150.12

114.98

从上述结果来看，从橙汁饮料里面一共鉴定测定了156个香气挥发性组分。主要是甜橙油的组分。柠稀含量很高，另外添加乙醛，乙酸乙酯，丁酸乙酯，脂肪醛，松油醇，等组分。部分组分含量从添加的果汁而来，部分从添加的食用香料香精而来。添加部分的天然油成分为主，附加一些其他香料组成。还有乳化剂等。
2.4. 用乙醚戊烷（1:1）提取的组分量要比二氯甲烷提取多一些，总量也多些。分别是150和115mg/kg。但有些组分二氯甲烷提取多一些，有些用乙醚：戊烷（1:1）没有提取到。
2.5. 一般讲，用二氯甲烷萃取对极性组分和非极性组分都可以提取，试剂容易得到。不像乙醚购买手续复杂，使用前还必须重蒸处理。但二氯甲烷在极性柱子上面和乙醇峰靠近，由于溶剂延迟而无法检查到乙缩醛，乙酸乙酯等组分。另外二氯甲烷属于卤素化合物可能会对环境（臭氧层）有影响，根据蒙特利尔国家化学公约，应当减少其使用。

分
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