摘要:建立了稀酸加热振荡提取-电感耦合等离子体质谱仪测定植物油中的痕量硒方法，优化了提取过程中的温度和稀酸浓度，优化后的条件为：2g植物加入10%硝酸(V/V)，在80℃加热振荡条件下，70分钟时间可将植物油中的蛋白态硒转化为游离态硒并提取完全。优化后的方法线性范围为0.2~40μg L-1，方法检出限为0.2μg kg-1，加标回收率在90.2%～105%之间，测定的相对标准偏差（RSD，n=6）小于5.0%，方法简单快捷、灵敏度高、稳定性好，同时该方法与传统的微波消解法测定的结果无显著性差异(P>0.05)，方法准确可靠。
关键词:植物油，硒，提取法，电感耦合等离子质谱仪。
硒是人体必需的微量元素，缺硒可导致人体一系列疾病，硒的抗氧化作用，可缓解冠心病、心脏病的临床症状，另外，针对糖尿病的防治，补硒不仅可以降低糖尿病患病的风险，而且可以辅助治疗糖尿病。研究发现：部分儿童贫血症状与硒摄入量过低有关。中国的大部分地区属于缺硒地区，缺硒人口占总人口的一半以上，2014年发布的《中国居民膳食营养素参考摄入量》推荐中国硒的日摄入最低量为60μg，但通过正常的饮食摄入，大部分中国人都达不到这个量。因此，富硒食品的消费的已逐渐成为补硒重要途径。富硒植物油是近年来开发的一类富硒产品，目前已实现了商品化，常见的有富硒菜籽油、花生油、玉米油和油茶籽油等，针对富硒植物油的研究，国外学者通过施用叶面硒肥得到的富硒橄榄油，其硒含量高达0.96mg/kg，国内学者马小灵等采用施硒肥技术方式得到未精炼茶油中的硒含量达0.04mg/kg。
目前针对植物油中硒含量的测定可采用国标法GB 5009.93-2017《食品安全国家标准食品中硒的测定》，其前处理采用硝酸、双氧水、高氯酸消解，而植物油的主要成分为甘油三酯，为了彻底去除有机物需要消耗大量的酸，另外，研究认为：高油脂样品采用常规的微波消解会有大量碳残余，如采用电感耦合等离子质谱仪测定，其基体效应会使测定结果偏高；完全分解需进一步敞口消解或者采用超高压微波进行消解，但称样量一般不超过0.5g。有不少学者采用灰化法、稀释直接进样法、酸提取，其中酸提取法设备简单、操作过程快捷，被众多研究者采用，并且效果良好。课题组在之前的研究中对植物油中铅、砷、铁、铜等9种元素采用硝酸旋涡提取测定，通过与酸消解方法的对比，结果有较好的一致性，但针对硒元素的测定，与酸消解的方法相比，提取法要严重偏低，这可能与硒元素在植物油中的存在形式有关（油料中蛋白态硒，采用压榨工艺转移到油中，大部分仍将以蛋白态的形式存在），如需准确的测定植物油中的硒含量必须将油中的非水溶的蛋白硒转化为水溶的游离态硒。本研究拟采用稀酸加热振荡的方式将植物油中的蛋白硒分离并提取，离心后的样品溶液采用电感耦合等离子体质谱仪进行测定其硒含量。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
AL104万分位天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；Nexion300D 电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）（美国PerkinElmer公司）,配备99.999% CH4气体；Mars 6微波消解仪（美国CEM公司），SHA-C加热振荡器（常州国华仪器有限公司）；50mL刻度离心管（美国Thermo Fisher Scientific公司）。
硝酸（优级纯，65%，美国Thermo Fisher Scientific公司)；过氧化氢（优级纯，国药集团化学试剂厂；高氯酸（优级纯，国药集团化学试剂厂)；100mg/L硒单元素标准溶液(GBW(E)080215)、蒜粉标准物质（GSB-13）、100mg/L内标物（45Sc）由国家标准物质物中心处购得；质谱调谐液由PerkinElmer公司处购得。实验中配制试剂的水均为一级水，由Milli-Q Gradient（德国Merckmillipore公司）制取，现制现用。
在进行样品测试之前，采用质谱调谐液对仪器进行调谐优化，具体要求如下：灵敏度In ≥ 40,000 cps/ppb，氧化物CeO/Ce≤ 2.5%，双电荷Ce++/Ce≤ 3%。为了去除质谱干扰得到理想的灵敏度，满足植物油中痕量硒元素的测定要求，本实验选择80Se质量数，在动态反应池（DRC）条件下，采用CH4作为反应气来消除80Ar+Ar+的干扰。实验采用10%硝酸溶液配制10μg L-1硒元素标准溶液进行仪器优化，通过优化后得出当CH4流量为0.9mL/min, Rpq电压为0.7时硒元素的信号最强背景浓度最低，具体ICP-MS参数设置见表1。
表1 ICP-MS工作参数
Table.1 Working Parameters of ICP-MS
| 仪器参数 Parameters | 设定值 Set value | 仪器参数 Parameters | 设定值 Set value |
| RF功率 | 1100W | 模拟电压 | -1859V |
| 雾化气流量 | 0.98/min | 脉冲电压 | 1306V |
| 等离子气流量 | 14 L/min | 扫描方式 | Peaking |
| CH4流量 | 0.90L/min | 扫描次数 | 20次 |
| RPq值 | 0.8 | 读数 | 1次 |
| 透镜电压 | 6.80V | 重复次数 | 3次 |
1.2样品前处理
提取法：用万分位天平称取约2g（精确至0.0001）植物油于50mL刻度离心管中，加入10mL10%硝酸(V/V)，拧紧盖子后再用封口膜封住盖子与离心管，倾斜45度角置于振荡器上，在转速220转，水浴温度80℃条件下，振荡提取70min，取出后将混合液离心（8000r/min，3min），用5ml巴氏吸管小心吸取下层液体于进样管中（提取液从吸管放下前先用纸巾擦除吸管表面的油，防止油液进入待测液），上机备用，同时做样品空白。
微波消解法：用万分位天平称取约0.2g（精确至0.0001）植物油于聚四氟乙烯消化管中，加入4mL硝酸和2mL过氧化氢，密封好消化管，放入微波消解器，微波消解程序为：先10分钟上升至130℃，保持5分钟，再10分钟上升至200℃保持30分钟，消解完毕后，以200℃赶酸至罐内液体剩余0.5ml左右，再补加2ml硝酸和0.5ml高氯酸，直到液体变清亮，赶酸至近干，冷却后用纯水定容至10mL摇匀，上机备用，同时做样品空白和质控样。
2 结果与讨论
2.1油/提取液比例的选择
油/提取液比例越大，仪器测定的灵敏度越高，但考虑到提取液在下层，过大的称样量会导致油层过厚，从而难以吸取不带油相的下层提取液，或者得到的提取液的体积难以保证ICP-MS的正常测定。因此，在保证灵敏度前提下，实验选择了1:5（2g油/10ml 提取液）的比例进行实验，在此条件下，混合物能够在振荡器中充分振荡混合，离心后可得到大于3ml的清液用于上机实验。
2.2 提取温度的选择
选取富硒菜籽油（通过微波消解前处理进行测定其硒含量为47μg/kg）作为优化实验样品。实验采用水浴辅助加热的方式来加快蛋白态硒转化为游离态硒的速度，选择10%硝酸V/V）采用20℃、40℃、60℃、70℃、80℃、90℃，6个温度条件下进行提取实验，与微波消解的结果比较来计算其提取效率，提取到达平衡所需要的时间作为提取完成的标志。由图1可知：在20℃条件下提取时间最短，10分钟即可到达平衡，但提取效率只有32.3%，提取效率随着温度的上升而升高，在70℃、80℃和90℃条件下提取效率最高，分别为94.8%和96.3%和92.1%，这说明在这两个温度条件下植物油中的蛋白硒已基本转化为无机硒。由于水浴振荡器设置的水温越高，需要越长时间预热，因此，实验选择70℃作为提取温度的最佳条件。
图1不同提取温度下，植物油中硒的提取率（左侧纵坐标，折线图）和提取平衡时间（右侧纵坐标，柱状图）。
Fig. 1 Influence of extractiontemperature to the extraction efficiency and balance time. Bars represent balancetime (min). Lines (-■-) represent extraction efficiency (%).Error bars represent standard deviations. Average ± Standard deviation, n=3.
2.3酸提取液浓度的选择
为了得到最佳的提取效果和最少的酸使用量，分别选取了不同浓度硝酸作为提取溶液，进行植物油中硒元素提取率优化试验。选取硝酸浓度（V/V）为0%，2%，5%，7%，10%，15%作为提取剂，由图2可知0%的酸度下，无法提取植物油中的硒，硝酸浓度为2%-5%的条件下，经过120min的震荡提取后其提取效率仍低于70%，这说明低浓度酸条件下，植物油中的蛋白硒释放较慢，在短时间内（120min）蛋白态硒无法释放成游离态硒，硝酸浓度为7%条件下，经过120min的震荡提取其提取效率可达90.5%，10%和15%的硝酸浓度其提取效率分别为97.3%和97.8%，并且其提取平衡时间均为70min，综合考虑提取时间和酸的使用量情况，选择10%的硝酸作为提取剂。
图2不同硝酸浓度下，植物油中硒的提取率（纵坐标）和提取平衡时间（横坐标）。
Fig. 2 Influence of differentnitric acid concentration to the extraction efficiency (Y-axis) and balancetime (X-axis).
2.4方法线性范围、检出限、准确度和精密度
根据植物油中的硒含量以及DRC条件下硒元素的响应情况，硒元素线性范围为0.2~40μg L-1，线性相关系数为0.9998，按1.4所述的方法制备11个独立的空白溶液，然后进行上机测定，计算其标准偏差，检出限为其3倍的标准偏差(表3)，通过折算称样量和提取液体积可知硒元素的方法检出限为0.2μg kg-1可完全满足痕量硒元素测定的要求。同理，计算微波消法前处理的方法检出限为5μg kg-1，稀酸提取法的灵敏度要远大于微波消解法，优势明显。
本试验选择3种植物油作为加标基质，通过低、中和高3个含量进行加标测试并计算其回收率，结果见表5，由表可知：硒元素的加标回收率在90.2%～105%之间，并且其计算其重复性，RSD结果均小于5%(n=6)，由此可见，整个提取过程不存在硒元素损失情况，同时通过内标校正后，基体效应对上机液影响较小，检测方法稳定可靠。
表3 稀酸加热提取植物油样品加标回收率(n=6)
Table 3 Results of recovery test (n=6)
| 样品名称 Sample | 原样品含量 Background (μg kg-1) | 添加量 Added/ (μg kg-1) | 测得量Found/ (μg kg-1) | 回收率 Recovery/% | RSD (%) |
| 菜籽油 | 47.3 | 5 | 51.8 | 90.2 | 3.7 |
| 20 | 68.3 | 105 | 2.6 |
| 100 a | 149 | 102 | 4.3 |
| 花生油 | 12.5 | 5 | 16.7 | 84.4 | 3.8 |
| 20 | 33.3 | 104 | 2.1 |
| 100 a | 109 | 96.5 | 1.4 |
| 山茶籽油 | 2.11 | 5 | 6.69 | 91.7 | 2.7 |
| 20 | 21.5 | 96.9 | 1.3 |
| 100 a | 103 | 101 | 2.5 |
2.5实际样品的测定
收集的10种植物油18个样品主要来源于大型超市、农贸市场以及网络电商，其中精炼植物油有9个，未精炼毛油有9个，标有富硒字样的植物油有4个，为了进一步验证方法的准确度，实验采用分别采用稀酸加热提取法和微波消解法对样品进行处理，测定结果如表4所示，采用提取法和微波消解法测定的18个植物油样品中，只有2个样品的硒含量这两种方法均有检出，并且结果无显著性差异(P>0.05)，另外，5个植物油样品采用稀酸提取法有检出，但采用微波消解法未检出，这是因为微波消解法方法检出限较高，灵敏度不够，其余样12个样品两种方法均未检出硒元素含量，其中精炼油样品中硒元素均未检出，这说明精炼过程去除了包括蛋白硒在内的硒元素。其中菜籽油2、菜籽油3、油茶籽油3、芝麻油2为外包装标有富硒油字样的油品（但没有标明硒含量），硒含量范围在0.55~47.3μg kg-1之间，《中国居民膳食营养素参考摄入量》推荐中国硒的日摄入最低量为60μg，按中国营养学会推荐的成人每人每天油脂摄入25克的标准计算，成人可从这些植物油中摄入硒量为0.013~1.18mg，因此通过植物油对硒的日摄入量的贡献率非常低，因此从所测样品分析来看，富硒植物油对硒元素的补充贡献可忽略。
Table 4采用稀酸加热提取法和微波消解法测定10种植物油样品的结果(n=3)
Table 4Results (mg kg-1) obtained for 10types of vegetable oil using diluted nitric acidextraction and detection by ICP MS (n=3).
| 精炼植物油 Refined vegetable oil | 提取法 Extraction method (μg kg-1) | 微波消解法 Microwave digestion method (μg kg-1) | 未精炼植物油 Unrefined vegetable oil | 提取法 Extraction method (μg kg-1) | 微波消解法 Microwave digestion method (μg kg-1) |
| 玉米油1 Corn oil 1 | NDa | ND | 菜籽油2 Rape seed oil 2 | 47.3±0.2 | 49.4±1.9 |
| 玉米油2 Corn oil 2 | ND | ND | 菜籽油3 Rape seed oil 3 | 0.55±0.2 | ND |
| 菜籽大豆调和油 Rape seed and soybean blend oil | ND | ND | 油茶籽油2 Camellia seed oil 2 | ND | ND |
| 花生油1 Peanut oil 1 | ND | ND | 油茶籽油3 Camellia seed oil 3 | 2.11±0.1 | ND |
| 葵花籽油1 Sunflower seed oil | ND | ND | 芝麻油1 Sesame oil 1 | ND | ND |
| 油茶籽油 1 Camellia seed oil 1 | ND | ND | 芝麻油2 Sesame oil 2 | 1.93±0.01 | ND |
| 大豆油1 Soybean oil 1 | ND | ND | 核桃油 Walnut oil | 3.34±0.1 | ND |
| 大豆油2 Soybean oil 2 | ND | ND | 花生油 2 Peanut oil 2 | 12.5±0.5 | 13.6±2.4 |
| 菜籽油1 Rape seed oil 1 | 0.73±0.06 | ND | 橄榄油 Oliver oil | ND | ND |
a：表示低于检出限
3.结论
实验建立了一种适合于食用植物油中痕量硒元素的前处理方法，样品经稀酸加热提取，离心分离后的溶液采用电感耦合等离子质谱仪测定痕量硒元素，针对质谱干扰问题，采用CH4气体进行反应去除。稀酸加热提取法与微波消解法相比，结果无显著性差异(P>0.05)，但简单快捷、灵敏度高，可适用于植物油中硒元素的测定，该前处理方法通过适当的方法优化和验证，可用于植物油中其它金属元素的测定。同时本实验对市售的18个植物油样品进行了测定和评价，结果显示：硒元素含量范围为未检出~47.3μg kg-1，通过日摄入量计算，所测样品无论是普通植物油还是富硒植物油对人体硒元素补充贡献不大。
| 样品名称 Sample | 原样品含量 Background (μg kg-1) | 添加量 Added/ (μg kg-1) | 测得量Found/ (μg kg-1) | 回收率 Recovery/% | RSD (%) |
| 菜籽油 | 47.3 | 5 | 51.8 | 90.2 | 3.7 |
| 20 | 68.3 | 105 | 2.6 |
| 100 a | 149 | 102 | 4.3 |
| 花生油 | 12.5 | 5 | 16.7 | 84.4 | 3.8 |
| 20 | 33.3 | 104 | 2.1 |
| 100 a | 109 | 96.5 | 1.4 |
| 山茶籽油 | 2.11 | 5 | 6.69 | 91.7 | 2.7 |
| 20 | 21.5 | 96.9 | 1.3 |
| 100 a | 103 | 101 | 2.5 |
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