酶标仪检测多糖

酶标仪检测多糖

酶标仪检测多糖可以同时多组进样，进样量小，可以节省检测时间，节省样品量，效率高，准确度高。本文是针对多糖含量检测的三种方法：苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸比色法、3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法，使用酶标仪进行检测的实验方案。

苯酚-硫酸法测定（苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，再以比色法测定）

一、实验试剂

多糖（样品）、5%苯酚溶液、浓硫酸、葡萄糖

二、实验仪器

50ml容量瓶、量筒、玻璃棒、洗耳球、烧杯、20ml具塞试管

三、实验步骤

最大吸收波长的确定：分别取1mL葡萄糖标准溶液和多糖溶液于20mL具塞试管中,用去离子水补充至1.0mL。向试液中加入1mL 5％的苯酚溶液，然后迅速加入5.0mL浓硫酸(与液面垂直加入，勿接触试管壁)，静止10min，使用漩涡振荡器充分混合，将试管置于30℃水浴锅中反应20min,同时以蒸馏水代替样液作空白，在400～500nm之间每隔10nm测定吸光度,确定最大吸收波长。

1、标准曲线的绘制

（1）取0.05g的葡萄糖于50ml容量瓶，加入蒸馏水溶解并稀释至刻度，再去5ml于50ml容量瓶，加蒸馏水稀释，即0.1mg/mL。

（2）分别量取0，0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准葡萄糖液置于20mL具塞试管中，用去离子水补充至1.0mL。向试液中加入5％的苯酚溶液，然后迅速加入5.0mL浓硫酸(与液面垂直加入，勿接触试管壁)，静止10min，使用漩涡振荡器充分混合，将试管置于30℃水浴锅中反应20min，在最佳波长下使用酶标仪测定吸光度。以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制定标准曲线。

2、样品的测定

取样品1.0mL于20mL具塞试管中，按照上述方法进行显色反应，于最佳波长下下测定吸光度，结合标准曲线计算多糖含量。（样品浓度：0.1mg/ml）

蒽酮—硫酸比色法（糖类在较高温度下可被浓硫酸作用而脱水生成糠醛或羟甲基糖醛后，与蒽酮（C₁₄H₁₀O）脱水缩合,形成糠醛的衍生物呈蓝绿色）

一、实验试剂

多糖（样品）、0.2%蒽酮硫酸溶液、葡萄糖

二、实验仪器

50ml容量瓶、量筒、玻璃棒、洗耳球、烧杯、20ml具塞试管

三、实验步骤

最大吸收波长的确定：分别取1mL葡萄糖标准溶液和多糖溶液于20mL具塞试管中,加入4.0mL质量浓度为2g/L蒽酮—硫酸溶液,在沸水浴中加热5min,取出自来水冷却10min,同时以蒸馏水代替样液作空白,在500～800nm之间每隔20nm测定吸光度,确定最大吸收波长。

1、标准曲线的绘制

分别量取0，0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准葡萄糖液置于20mL具塞试管中，用去蒸馏水补充至1.0mL。加入4.0mL质量浓度为2g/L蒽酮—硫酸溶液,在沸水浴中加热5min,取出自来水冷却10min,同时以蒸馏水代替样液作空白,在最佳波长下测定吸光度,绘制标准曲线。

2、样品测定

取样品1.0mL于20mL具塞试管中，加入4.0mL质量浓度为2g/L蒽酮—硫酸溶液,在沸水浴中加热5min,取出自来水冷却10min,于最佳波长下下测定吸光度，结合标准曲线计算多糖含量。（样品浓度：0.1mg/ml）

3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法（3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质，还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例关系，在紫外光下测定棕红色物质的吸光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量）

一、实验试剂

多糖（样品）、葡萄糖、DNS、2mol/L NaOH溶液、酒石酸钾钠

二、实验仪器

50ml容量瓶、量筒、玻璃棒、洗耳球、烧杯、20ml具塞试管、50ml三角瓶

三、实验步骤

DNS试剂制备：DNS试液的配制：称取6.3gDNS和262ml浓度为2mol/L的NaOH溶液。加到500ml含有182g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中，7天后使用。

总糖供试液和单糖供试液制备：精确称取2份多糖各50mg,分别置50mL三角瓶中,其中一瓶加10mL 6mol·L^-1盐酸和15mL蒸馏水,置沸水浴中加热30min,取出,冷却至室温,加酚酞指示剂1滴,用10%的NaoH溶液中和至溶液微红色,过滤,滤液定容至100mL,摇匀,作为总糖供试液。另一瓶中加10mL蒸馏水,溶解,加酚酞指示剂1滴,用10%的NaoH溶液中和至溶液微红色,用水定容至100mL,摇匀,作还原糖供试液。

最佳波长的确定：分别量取葡萄糖标准溶液(1mg/mL)、总糖供试液和单糖供试液各1mL与1.5mLDNS试剂反应,同时以蒸馏水代替样液作空白,在440～680nm之间每隔20nm测定吸光度,确定最大吸收波长。

1、标准曲线的绘制

分别量取0，0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准葡萄糖液置于20mL具塞试管中，用去蒸馏水补充至2.0mL。每支试管中加入1.5 mL的DNS试剂，混合均匀，于沸水浴中加热5min，取出后立即浸入冷水冷却至室温，再用蒸馏水定容至25ml刻度处，摇匀，于最佳波长下下测定吸光度，绘制标准曲线。

2、样品的测定

取多糖溶液1mL于25ml具塞试管中,加入DNS试剂1.5mL，于沸水浴中加热5min，取出后立即浸入冷水冷却至室温，再用蒸馏水定容至25ml刻度处，摇匀，于最佳波长下下测定吸光度，结合标准曲线计算多糖含量。（样品浓度：0.1mg/ml）