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【实战宝典】荧光激发波长与荧光发射波长有什么关系?
小官人
2021/03/23
私聊
液相色谱(LC)
问题描述:物质的紫外最大吸收波长是否可以作为荧光激发波长?荧光激发波长与荧光发射波长之间存在什么样的关系,发射波长又要如何选择呢?
解答:
(
1
)荧光产生的原理在前文中已有介绍,需要注意的是电子跃迁时吸收或发射的能量并不是任意的,而是受到电子能级的制约,只能吸收或发射一定波长范围内的光。含有共轭双键体系的有机化合物,容易吸收激发光,其激发波长大多处于近紫外区或可见光区,发射波长多处于可见光区。由于荧光涉及光的吸收和发射两个过程,因此任何荧光物质都有两种特征光谱,即激发光谱和发射光谱。
(
2
)光的发射波长和激发波长之间的差值叫斯托克斯(
stokes
)位移,斯托克斯位移越大,其激发光谱和发射光谱的重叠就越少,就有利于提高其分辨率。分子的第一激发态与基态的能差是一定的,因而荧光波长不随激发光波长的改变而发生变化。分子激发过程中吸收的能量一般高于荧光辐射释放的能量,二者之差以热的形式损耗,因此荧光波长比激发光波长要长,其差通常为
50~70nm
,当有机化合物分子内可以形成氢键时,则增至
150~250nm
。荧光的强度受许多因素的制约,如激发光源能量、吸收强度、量子效率等。量子效率也称量子收率,是指荧光物体分子发射的光量子数与吸收的光量子数之比。其大小是由分子结构决定的,而与激发光源的能量无关。
(
3
)荧光属于光致发光,需选择合适的激发光波长以利于检测。激发波长可通过荧光化合物的激发光谱来确定。激发光谱的具体检测办法是通过扫描激发单色器,使不同波长的入射光激发荧光化合物,产生的荧光通过固定波长的发射单色器,由光检测元件检测。最终得到荧光强度对激发波长的关系曲线就是激发光谱。在激发光谱曲线的最大波长处,处于激发态的分子数目最多,即所吸收的光能量也最多,能产生最强的荧光。因此大多数物质的紫外最大吸收波长可以作为激发波长,激发波长的选择并不影响发射波长的选择,理论上激发光谱和发射光谱有一个镜像关系。很多人误以为,激发波长和发射波长是一一对应的,其实不然,激发光谱的强弱只代表该物质在所选择的激发波长下被激发的比率,其发射光谱还是原来形状的光谱,只是在强弱上改变。我们选择最大激发波长是为了获得高激发率的物质形态,间接提高灵敏度,选择最大发射波长是为了直接提高灵敏度。
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