仪器信息网APP
选仪器、听讲座、看资讯
立即体验
APP内打开
回版面
1
4
点赞
拍砖
举报
取消
发布
当前位置:
仪器社区
>
色谱
>
液相色谱(LC)
>
帖子详情
【原创】液相学习|1|:液相(LC)方法开发的常规套路
质谱学堂
2021/05/16
私聊
液相色谱(LC)
▉ 导读
您有没有遭遇过在仪器前折腾了半天,还有出现一个理想中的目标峰?
那么如何建立良好的色谱分析方法了?
方法建立一般包括以下步骤:
基线分离和合理的分离时间
样品组成和分离目标的评估;
样品的预处理;色谱模式的选择;
检测器的选择;
分离条件的选择;
潜在问题的预估,识别和解决之道;
方法确证和系统适应标准的确定。
这其中的一些步骤并不是必需的,或者它们不需要我们花太多的精力。“困难”的样品和要求很高的分析程序可能会超出简单重复上面所罗列的步骤的范畴。也就是说,在方法建立过程中出现特殊问题的时候,需要有一个逻辑的对策,以色谱操作员之前的经验和对文献记录的接触或熟悉程度为基础。
▉ 样品组成和分离目标的评估
在方法建立之初,应该对样品的化学组成有一定的掌握。如果样品中有酸性或者碱性的化合物,那就有必要在流动相里加入缓冲液来控制流动相的pH;样品化合物的pKa值,如果知道的话,对方法建立都会非常有帮助,样品的分子量也有可能影响起始实验分离条件的选择,样品中存在有对映异构体的则需要针对它们的分离建立一个特殊的方法。
一个样品的分离目标可能不仅仅局限于足够的分离度和最短的分离时间。对于最终方法的常规应用取决于可用的设备,梯度洗脱可能无法实现(那就需要等度洗脱的方法)。痕量分析,也就是测定化合物中的杂质,可能对样品配备和检测器都有额外的要求。定量分析要求设定最低的精确度(比如主要成分在±(1%-2%)之间和痕量成分在±(10%-20%)之间),然而,通常来讲样品中只有一些成分需要被分离;例如,血中或尿液中的药物或者水或土壤里样品里的杀虫剂。
▉ 样品的预处理
在样品进样之前可能需要对样品做一些处理以便能除去那些可能会损害柱子或者干扰目标的化合物成分。样品的预处理流程包括多个步骤,并且也包括使用各种各样的分离基质。因为这个原因这些步骤比后面的HPLC分离更加难以建立。当相似的样品和样品基质的预处理流程已经存在(或者在同一个实验室建立或者在文献里报道过),针对分析样品来使用或者改编现有的预处理流程通常是比较好的方法,因为这样就可以避免完全重新建立样品预处理的程序了。
▉ 色谱模式的选择
反相色谱法是HPLC方法建立的一个默认选择。但是,取决于样品本身,其他的色谱模式也许会更合适。通常要等到初始的使用反相色谱法(RPC)的实验无法成功的时候,使用其他色谱模式的需求才会变得更加明显。同理,如果样品中有异构体化合物,而且难以被反相色谱分离,那么使用以无键合的硅胶填充的色谱柱的正相色谱法(NPC)可能会更加容易获得成功。无键合硅胶的正相色谱法也是制备规模分离的首选。
▉ 检测器的选择
当样品成分中有足够的生色团,可调波长的UV检测器一般是首选。目标样品成分的分子结构可能预示使用一种检测器会比另外一种检测器更加合适,假如样品成分的结构是未知的,并且可能不能被UV检测,那么我们在分析这些样品的时候就需要使用基于蒸发光散射或者(比较少见)折光指数的非特异性检测器。质谱检测器(
LC-MS
)可用作UV检测器的补充,因为它的多功能性因此可以用于处理很多类型的样品和分离目标。我们可以预见,将来
LC-MS
技术的使用可能会大幅上升,而质谱检测器可能有一天会成为大多数HPLC应用首选的检测器。
▉ 分离条件的选择
对于大多数样品,我们可以根据三个连续的步骤以一个系统化、反复测试的方法来进行(分离条件的选择):
1、改变流动相的强度(%B)直到实现合适的保留范围,比如,1≤K≤10;
2、应对不同的分离条件进行研究直到获得可接受的选择性(a值)和分离度为止。为了改善选择性,首先需要改变的色谱条件应为%B(例如±10%B)和温度(例如30-50℃),如果一些峰仍然重叠或者分离不彻底,也可以改变其他条件来改善选择性。
3、改变柱子的条件:柱子长度、颗粒大小和(或)流动相流速。改变柱子条件的确能够稍微提高塔板数N和分离度,但代价通常是要忍受更长的分离时间(实验操作时间),当优化选择性完成之后,样品的分离度比必需的(R>>2)还要更好的话,那么通过把柱子长度缩短和(或)者增加流动相流速就让实验时间大幅缩短。基于上面描述,在多数情况下,满意的分离效果可以在一天或者两天内实现。
对于那些涉及大量样品的分析方法,在保持足够分离度的同时还要让实验操作时间尽可能地短,因此在实验的初期花更多的时间展开“筛选”实验是更有价值的。实验中可能会使用不同的柱子、不同的B溶剂和不同的流动相pH以及不同的温度。在实验中使用梯度洗脱的方法有助于避免研究每个变量(例如柱温、色谱柱的类型都属于变量)时都需要分别优化%B值的麻烦。
还有一个方法就是搜索文献中对于同样或者类似样品的分离方法的记载。在此基础上还需要不断进行反复试验来优化色谱条件直到获得适合的分离效果。我们不推荐这个方法,因为文献中的方法可能存在不足;这此不足可能会延误我们之后为了获得最终可靠的分离方法而作的尝试。然而除了选择分离条件之外,文献记载的分离方法对于选择检测器和检测条件,以及为一个特殊的分析物或样品选择样品配备方法都很有用。
关注微信公众号“质谱学堂”, 即可领取 ”色谱系列丛书 ” 相关书籍,共12本。
相关话题
1
液相色谱仪测定环境空气中的酚类化合物
2
大家都是如何维护保养的?
3
UV123和UV400的液相检测方法
4
求问HPLC光电二极管阵列检测器条件可以用到紫外检测器吗(我们实验室的HPLC)配置的是紫外检测器?
5
求助!!!
+关注
私聊
anna198871
第1楼
2021/05/16
感谢分享,共同学习
0
发表回复
近期热榜
迎国庆送壕礼!十月发帖抢大疆云台
【官方邀请】高效液相色谱使用情况有奖调研
喜迎国庆!第十七届原创大赛超级原创日参赛奖励翻倍
丹纳赫四十周年寄语征集领大礼包
热门活动
【售后专场--招聘会】
第三届微课大赛投票进行中ing
猜你喜欢
最新推荐
热门推荐
更多推荐
【讨论液相潜力】仪器篇之检测器
2009/04/03
用于生物治疗药物的N-糖分析和唾液酸定量方案
分享
2020/03/03
【求助】请教:有关物质方法验证问题??
2010/05/11
HPLC新书---HPLC Detection: Newer Methods,看看目录就很诱人
2005/06/03
黄曲霉毒素B1标准样用甲醇稀释后测定值降低
求助
2016/12/27
德国关于PAH的法律在那里能够找到。
2006/04/17
【求助】有关岛津液相色谱CLASS-VP的说明书或者操作录像
2008/07/27
液相色谱中几种溶液概念的辨别
求助
2019/07/30
岛津液相色谱再解析软件错误提示
求助
2024/10/01
高效液相色谱基础篇|关于反相色谱柱维护保养及注意事项小知识
分享
2024/09/30
高效液相色谱基础篇|关于反相色谱柱使用的小知识
分享
2024/09/30
高效液相色谱基础篇|关于色谱柱平衡的小知识
分享
2024/09/30
高效液相色谱基础篇|关于接头的小知识
分享
2024/09/30
高效液相色谱基础篇|关于管线使用的小知识
分享
2024/09/30
高效液相色谱基础篇|关于系统适用性标准考量的小知识
分享
2024/09/30
全新安捷伦液相1290急出
原创
2024/09/30
用实力证明 - 技术人员能力好坏“我说行就行”的时代过去了?
第十七届原创
2024/10/02
同一个部门的人进门还让登记,宝宝很生气!
第十七届原创
2024/10/03
要想新员工学的快,培训技巧很重要!
第十七届原创
2024/10/04
【仪器心得】TDU2第二套热脱附使用心得
第十七届原创
2024/10/02
出峰时间和分子离子峰一样,二级质谱图不一样是同种物质吗
已应助
2024/09/28
玻璃器皿的质保期
已应助
2024/09/28
关于CNAS-G001:2024里的条款理解?
已应助
2024/09/30
岛津2014色谱TCD检测标气中的氧气和氮气,氧气不出峰怎么处理
已应助
2024/09/29
液相浓度太低 测不出来
已应助
2021/05/16
上海:17日起启动76岁及以上人群新冠疫苗登记预约接种工
讨论
2021/05/16
15日0时至19时,辽宁新增4例本土确诊病例(沈阳1例、营口3例)、5例无症状感染者
讨论
2021/05/16
大连:对营口鲅鱼圈来返大连人员实施14天居家隔离2次核酸检测
讨论
2021/05/16
希腊:向国际开放旅游业,游客核酸阴性或已接种疫苗即可入境
讨论
2021/05/16
遇到事,先处理情绪,后处理事情,情绪处理不好,事情会更糟!
讨论
2021/05/16
香港已接种逾192万剂新冠疫苗,超77万人已接种第二剂
讨论
2021/05/16
台湾单日新增180多例:岛内民众排长队抢购卫生纸,超市货架被扫空
讨论
2021/05/16
品牌合作伙伴
丹纳赫苏州基地 打工人的梦想
岛津
日立科学仪器
珀金埃尔默仪器(上海)有限公司(PerkinElmer)
日本电子株式会社
丹纳赫
安捷伦
赛默飞世尔科技
普析通用
欧波同
天美
天瑞仪器
德国耶拿
海能技术
马尔文帕纳科
磐诺科技
上海仪电科仪
梅特勒托利多
聚光科技
莱伯泰科
盛瀚
多宁生物
丹东百特
科哲
卓立汉光
屹尧科技
华谱科仪
宝德仪器
优莱博
HORIBA
布鲁克核磁
举报帖子
执行举报
点赞用户
好友列表
加载中...
正在为您切换请稍后...