论文主题： 红曲黄素
姓 名：海琪
红曲黄素
摘要：种类繁多的红曲黄色素,是红曲菌发酵法生产的天然色素。本文对红曲黄素的性质、生产、分离、检测和应用进行了综述，希望能为红曲黄色素的开发、应用提供一些理论参考。
关键词：红曲黄素；理化性质；生产；检测；应用
食品着色剂(色素)是食品工业不可或缺的食品添加剂之一。食用色素通常分为化学合成色素和生物色素。天然的生物色素中,红曲色素(包括红曲米色素及红曲红色素)是世界上最成功的利用微生物发酵法大规模生产的、并广泛应用于食品的天然生物色素,其历史悠久,生产技术成熟,价格便宜[1]。且营养、无毒、对身体并无任何毒害作用和致突变作用,广泛应用于肉品、调味品、酿酒等食品行业,因此红曲色素一直是天然食品色素研究的热点[2]。
1.概述
红曲色素是红曲霉在生长过程中产生的次级代谢产物,属于聚酮类色素,其中有6种成分,Ankaflavine与Monascine是黄色素。Rubropunctatin与Monascorubrine是红色素,Rubropunctamine与Monascorubramine为紫色素，6种成分结构相近,略有差异。2004年,泰国的Yongsmith,B.等人从筛到的单产黄色素红曲霉Monascus kaoliangKB20M10.2中分离到两种新结构的黄色素,monascusonesA和monascusonesB,并通过光分析与核磁共振数据推导其结构式分别如下，通过对结构式的研究,发现monascusoneA与monascin在6位H和7位H旋光性上具有相似性[3]。
近几十年来,国内外研究者对红曲黄色素及其生产技术的研究在不断深入。人们对红曲黄色素的认知也在不断加深,现在可以明确的是,由于红曲菌种的多样性及生产方法的不同, 红曲黄色素的种类和性能呈现多样性。近几年,一种利用红曲色素为原料, 通过化学合成方法制得的“红曲黄”已经面世,且制定了红曲黄色素产品的国家标准。该标准适用于以红曲米为原料，经碱液洗脱，分离制得红曲红（或直接以红曲红为原料），经硫化物磺化，干燥制成的食品添加剂红曲黄色素。感官要求应符合：色泽为橙红色至黄褐色，状态为粉末状。检测方法为:取适量试样置于清洁、干燥的白瓷瓶中，在自然光线下，观察其色泽和状态。
理化标准应符合下图规定[4]：
2.红曲黄素的理化性质
2.1色调及最大吸收波长
红曲黄色素的最大吸收波长范围较大,这也是与其结构和性质的多样性紧密相关的,其中最常见的2种红曲黄色素,即红曲素和安卡红曲黄素的最大吸收峰分别为420nm和388nm。
江南大学许赣荣等使用薄层层析对脂溶性红曲黄色素进行了分离,结果如图2.1所示。可见光下发现2条黄色素条带,紫外光下可见上方条带比下方条带亮。Rf值分别为0.869、0.817,最大吸收峰分别出现在421、409nm处,分离的黄色素的纯度未经严格检测。
图2.1红曲黄色素在薄层层析上的分布
2.2溶解性
研究表明，红曲色素中的脂溶性色素均能溶于乙醇、乙醚、醋酸、正己烷等溶剂中，其溶解度以在醋酸中最大，在正己烷中最小。红曲色素中水溶性色素则与溶液pH有关，在碱性和中性溶液中极易溶解，在pH＜4时，红曲色素的溶解度逐渐减小直至出现沉淀[5]。
红曲菌发酵所产的黄色素主要有疏水性和亲水性两大类,目前占大多数的是疏水性的红曲黄色素。疏水性的红曲黄色素一般具有13、17、19、20、21、22或23个碳原子,而亲水性的红曲黄色素则一般具有21或23个碳原子,且其平均分子量在344到404之间,因此,在结构的多样性上,疏水性的红曲黄色素要高于亲水性的黄色素。疏水性的红曲黄色素在有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮、己烷、乙苯、乙酸乙酯、油脂)中溶解性较好[1]。
2.3稳定性
2.3.1光照对红曲黄素稳定性的影响：
红曲黄色素的稳定性随着自然光照时间的延长逐渐降低,而避光处理下色价值的降低较为平缓。自然光照射对红曲黄色素的稳定性影响明显大于避光处理。这说自然光照射对红曲色素的稳定性破坏最大,而避光处理条件下,红曲黄色素则显现出天然色素所具有的较好的稳定性。
紫外灯照射下的红曲黄色素色价值基本保持不变,照射5h黄色素的保存率依然高达94.2%,这说明紫外照射不会对红曲黄色素的稳定性产生影响。由此可见,红曲色素产品应尽量避免日光直射[6]。
2.3.2温度对红曲黄素稳定性的影响
当温度不高于80℃时，红曲黄色素残存率在95%以上，说明红曲黄色素可耐受80℃高温。但温度达到100℃时，红曲黄色素残存率低于90%。因此红曲黄色素发酵液在储存及处理过程中温度尽量低于80℃[7]。
2.3.3 PH对红曲黄素稳定性的影响
在PH<5.0和PH>9.0的环境下红曲黄色素的色价值均不稳定,色素溶液的颜色发生明显变化。黄色素的色价值在偏酸性及中性范围，pH5.0-9.0之间较为稳定,其溶液的颜色为鲜红色状态。极酸极碱性环境均不利于红曲黄色素的保存,这可能是因为在极端环境中红曲色素结构中的发色基团结构发生了变化,从而导致色价值发生变化。因此,红曲黄色素应尽量保存在中性环境下[6]。
2.3.4 金属离子对红曲黄色素稳定性的影响
不同的金属离子对红曲黄色素的影响不同。Na+,K+,Ca2+和Zn2+对红曲黄色素基本无影响,与空白相比色素溶液的颜色依然保持紫红色。重金属Fe2+和Cu2+对红曲色素溶液的色泽产生了明显的不利影响,溶液的颜色由紫红色分别变为橘黄色和棕褐色,且溶液中均出现混浊沉淀。可能是因为Fe2+与空气中的还原剂等物质发生了反应从而产生了混浊沉淀,亦有可能是因为红曲色素内部的分子结构容易被该类重金属氧化或结合形成络合物,所以产生了混浊沉淀。
因此,红曲黄色素无论是使用还是储存过程中都应尽量避免接触铜,铁等重金属离子[6]。
3.红曲黄素的生产
目前红曲黄色素的生产方法有：①完全发酵法:利用突变的红曲菌株发酵法生成;②酸性乙醇提取法:用盐酸酸化乙醇提取制备的红曲黄色素(在酸性条件下, 色素呈黄色)。③分离法:用大孔树脂分离红曲色素混合物,纯化制备黄色素;④还原法:以含硫化合物还原红曲色素,红斑素和红曲红素分子中的环羰基还原成羟基, 得到水溶性红曲黄色素;红曲红色素与连二亚硫酸钠在碱性溶液中反应,制得的水溶性红曲黄色素,结构分析表明是红曲红色素分子中的内酯水解物,分子中引入了磺酸基[9]。
在红曲菌发酵过程中, 合成的黄色素的种类和产量会受到菌种、发酵方式、发酵条件以及培养基的成分的影响。为了提高红曲黄色素的积累,可通过优化红曲菌发酵条件得以实现。例如：当以无机氮源为唯一氮源时，黄色素的色调超过1，此时红曲菌所产色素主要以黄色素为主。
图3.1氮源对红曲菌产红曲色素的影响
以麦芽糖、大米粉为碳源时，色素色调值大于1，此时红曲菌主要生产黄色素，其产量远高于其他色素成分。
图3.2碳源对红曲菌产红曲色素的影响
当初始pH在4～8范围内时，黄色素色调均大于1.0，红曲菌主要合成黄色素，尤其是当初始pH值为7时，黄色素产量为其他色素产量的1.33倍，黄色素色调值最高。
图3.3初始pH对红曲菌生长、色素产量及黄色素色调的影响
当培养温度超过30℃时，红曲色素色调值大于1.0，此时红曲菌合成黄色素量超过其他色素之和[8]。
图3.4培养温度对红曲菌生长、色素产量及黄色素色调的影响
近些年来,微生物萃取发酵已成为一种新兴的发酵方法,可以通过该方法积累更多的红曲黄色素。另外,通过添加一些非离子型表面活性剂,也可以促使红曲菌胞内橙色素向黄色素的转化。
除此之外,通过半合成法也可以将一些疏水性的红曲色素转化成亲水性的红曲黄色素。例如,一些疏水性的红曲色素与硼氢化钠反应可以得到亲水性的红曲黄色素。使用一些磺化剂如硫磺、三氧化硫和氯磺酸,也可以使疏水性的红曲红色素转化为亲水性的红曲黄色素。虽然可以通过这种半合成的方法得到更多的红曲黄素色, 但其潜在的安全性问题可能会限制它们在食品工业中的应用[1]。
4．红曲黄素的分离
4.1萃取-吸附法
微乳液萃取和大孔树脂吸附的方法可以实现从红曲色素发酵液中选择分离黄色素成分。由于表面活性剂和黄色素都更倾向于保留在同一相中,直接通过微乳液萃取实现黄色素和表面活性剂的分离效率较低。较之其他的有机溶剂,乙醚-水微乳液萃取法可以将表面活性剂同黄色素较好地分离开来。虽然有机溶剂无法直接用于黄色素与表面活性剂的有效分离,但是使用logP<2的有机溶剂微乳液萃取, 能够破坏发酵液中表面活性剂与色素形成的胶束结构,导致色素从胶束中释放和游离。通过下一步树脂选择性吸附,可以实现表面活性剂与色素的高效分离。
碱性S-8大孔树脂对黄色素的吸附率可达81.17%,而对表面活性剂的吸附率仅为2.53%。根据Weber and Morris粒内扩散模型,色素的吸附过程受膜扩散和颗粒内扩散等步骤限速。吸附的黄色素可以被含0.5%(w/v)盐酸的甲醇溶液有效洗脱。洗脱5次后总洗脱率可达79.48%[10]。
4.2硅胶柱层析法
硅胶湿法装柱后,以石油醚、乙酸乙酯、正己烷三种常用的低极性洗脱溶剂设计不同的体积配比对样品分别进行洗脱。硅胶柱层析法得到最佳分离条件为:最佳洗脱剂配比为正己烷∶乙酸乙酯(v/v)=1∶8;最佳上样量为1.5mL;最佳流速为50 mL/h。
分别考察红曲黄色素组分在菌体粉末、黄色素粗提物、纯化后样品的相对峰面积含量,采用相对定量法验证了红曲黄色素组分的纯化保存率达到了85%,由此验证了本实验的分离纯化方法具有明显效果,柱层析法粗分红曲黄色素基本满足了工业化生产需要的快速、高效、便捷等硬性需求[11]。
4.3超生提取法
超声波提取作为一种物理方法,具有提取时间短、效率高、纯度高、对有效成分结构破坏小等优点,被逐渐应用到各种天然色素的提取中。其中料液比、乙醇浓度、超声功率、超声频率、超声温度、超声时间等因素条件对红曲霉菌体的红曲色素提取效率均有影响。通过单因素条件和响应面分析后的优化条件是:在超声频率50kHz、超声温度60℃、超声时间50min、乙醇体积分数76.30%、液料比34.44∶1、超声功率为304.84W,在此提取条件下,提取液中红曲红组分色价为5679.4U/g,红曲黄色价为4633U/g,国标法提取红曲色素相比,提取率分别提高了6.5%和8.9%。
试验研究表明,超声辅助乙醇提取菌体中红曲色素不仅缩短了提取时间,也明显提高了色素提取率[12]。
5．检测
5.1 分光光度法
现有的红曲黄色素国家标准(GB 1886.66—2015)以及目前行业内习惯使用的仍是以分光光度计为基准的检测方法,该方法仍然适用于天然红曲黄色素的检测,在实际应用中也更为方便可行,但其关键是稀释溶剂种类及检测波长的确定。对于稀释溶剂的种类,由于存在疏水性和亲水性的红曲黄色素,并考虑到两种类型的黄色素在乙醇中的溶解度都较高, 根据实践,证明用一定浓度的乙醇水溶液作为溶剂仍是较好的选择。对于检测波长,根据文献报道的天然红曲黄色素种类较多的具体情况,检测波长应当设置在较大的范围内,天然红曲黄色素的乙醇溶液,在330-450nm有最大吸收峰。因此检测波长可定于此范围内,这也有别于半合成的“红曲黄”的检测波长(476nm)[1]。
5.2 高效液相色谱法
由于红曲色素单一组分的标准品不容易得到，HPLC法多用于分析红曲色素的组成。崔莉等[13]建立了同时检测红曲色素产品中红曲素和安卡红曲黄素的方法:Shim-Pack HRC-ODS柱(250mm×4.6mm,5μm);柱温:室温;检测波长:394nm;流动相:甲醇-水溶液(80:20);流速:1.0ml/min;进样量20μl。通过检测我国部分红曲色素产品,显示红曲素和安卡红曲黄素含量的不同可一定程度上反映红曲色素产品的组成。
5.3液相色谱－质谱联用技术
液相色谱-质谱联用技术在红曲色素产品的分析方面有着其独特的优势。马书名等[14]采用固相萃取净化技术和液相色谱-串连质谱联用技术相结合建立了食品中红曲红胺、红曲红素、红曲素、红曲黄素的检测方法，采用外标法定量，采用选择离子检测进行阳性确证，本方法检测结果准确可靠，线性范围宽，适用范围广，能够满足高质量检测的要求。
6．应用
红曲色素作为食品着色剂现已广泛应用于食品行业，而从现有的食品颜色上看，需要使用黄色素的场合更多。因此红曲黄色素较红色素在食品领域中具有更广阔的用途。GB2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定,红曲黄色素可应用于方便米面制品、糕点、熟肉制品、卤蛋、鸡精、鸡粉、果蔬汁(浆)类饮料、蛋白饮料、碳酸饮料、固体饮料、风味饮料、配制酒、果冻等食品的着色,均为按生产需要适量添加。
6.1肉制品
以盐焗鸡翅为实验对象,在感官评分中得出,使用了红曲黄色素上色的鸡肉制品具有颜色均匀饱和,色调鲜亮,光泽感好等显著特点。与栀子黄色素相比,红曲黄色素气味低,苦味少,应用后的鸡肉制品口感也相对较好。从性质看,红曲黄色素不但能应用在鸡肉制品,还能应用在其他肉制品上,具有广阔的应用前景和重大的市场价值,是肉制品增添色彩的一种安全可靠的着色剂[15]。
6.2果汁
开发的水溶性黄色素的λmax与合成色素日落黄十分接近，因而有可能取代这种合成色素。将黄色素试用于芒果汁、水蜜桃汁等饮料，结果表明，无论在着色性能上，还是在稳定性上，均有良好的效果[16]。
6.3方便面
在面饼中分别加入红曲黄色素0.01%、0.02%、0.03%、0.05%,其它添加剂按相同工艺操作，从实验结果中得出,红曲黄色素的添加量越多,颜色越黄,但并不是越多越好,添加量过多时颜色过黄,有些失真。故红曲黄色素的添加量以0.02%为宜。这使得面饼颜色较为诱人,且在保质期内褪色不明显。说明红曲黄素能赋予方便米面制品良好的外观色泽和风味,可以提高产品档次和增加使用效果[17]。
7.小结
综上，红曲黄色素符合食品添加剂“天然、营养、多功能”的发展方向，具有很好的应用前景。现常采用完全发酵法、酸性乙醇提取法、分离法、还原法、半合成法、微生物发酵法等多种方法生产红曲黄色素并可以采用萃取-吸附法、硅胶柱层析法、超生提取法等多种方法分离提纯红曲黄色素。作为食品着色剂，红曲黄素现已广泛应用于食品行业。研究和开发稳定无毒的红曲黄色素产品，对保障人民生命健康、提升食品色泽风味均具有积极的意义。
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