GB 5009.24-2016黄曲霉毒素M1的检测要点和如何顺利通过其能力验证
本文从三个方面（黄曲霉毒素M1免疫亲和柱使用的注意事项、氮吹对黄曲霉毒素M1标准物质的影响、如何顺利通过黄曲霉毒素M1的能力验证）分别对GB 5009.24-2016标准黄曲霉毒素M1的检测前处理部分的要点进行讲述，以及如何顺利地通过其能力验证
1 黄曲霉毒素M1免疫亲和柱使用的注意事项
由于样品中黄曲霉毒素M1含量低, 并且存在基质干扰现象, 往往需要进行一定的富集、洗脱处理, 标准GB 5009.24-2016中就有要求使用免疫亲和柱富集和洗脱。免疫亲和柱是采用上样富集、洗脱的方式, 黄曲霉毒素保留在填料上, 用有机溶剂洗脱。
免疫亲和柱的介绍：
（1）特异性抗体结合的凝胶填充到柱体中，选择性吸附样液中的待检物免疫亲和吸附具有专一性，一种抗体只能吸附一种毒素或一类毒素（如黄曲霉素）；
（2）为保证抗体活性，免疫亲和柱保存在保护液中，4℃-10℃冷藏储存（不得冷冻），使用前需回温；
（3）有效期一般为12-18个月；
（4）凝胶的在筛板下，一般不能耐受较大压力；
（5）厂家不同，抗体的装填量不同，对目标毒素的最大吸附量不同（柱容量）；
（6）厂家不同，凝胶和抗体的装填方式不同，最佳的过柱流速一般在（1-3）mL/min；
（7）不同的凝胶和筛板封装方式，样品处理过程中对是否干柱有较大区别；
（8）样品提取液（或用黄曲霉毒素M1标准物质做柱回收试验时）需加入水进行稀释，使得提取液甲醇含量从75%（或100%）降低至21%才可进行过免疫亲和柱富集洗脱，目的是防止过多的有机溶剂使免疫亲和柱失活。
（9）在人参和当归的净化过程中，如采用20 mL水作为淋洗液，其加标回收率为（70～80）%；而将10mL的缓冲液和10mL的纯水作为淋洗液时，可除去免疫亲和柱上残留的色素和基质，从而提高回收率约10%。
（10）进行洗脱时甲醇的过柱流速控制在1mL/min为宜。洗脱效果不佳时，可采取让甲醇浸泡免疫亲和柱（样液稀释液流至填料上约1cm关闭阀门，将SPE固相萃取装置下的三通阀门关上（1～2）min）后再加以洗脱。有1mL和3mL管两种，3mL比较好操作。
（11）由于黄曲霉毒素在紫外光照射下不稳定，因此在实验过程中应避免紫外光和太阳光的照射。
（12）免疫亲和柱柱容量及回收率确证
更换了厂家或者不同批号之前的免疫亲和柱，均要对其进行柱容量及回收率的确证，保证加入100ng的黄曲霉毒素M1标准物质的量时回收率至少要达到80%以上，方法如下：
2 氮吹对黄曲霉毒素M1标准物质的影响
2.1 不同品牌黄曲霉毒素M1标准物质按GB 5009.24-2016氮吹峰面积比较
（1）不同品牌黄曲霉毒素M1标准物质按GB 5009.24-2016条件氮吹峰面积比较
材料：某品牌的免疫亲和柱，黄曲霉毒素M1标准物质（A品牌、B品牌、C品牌），氮吹仪，液质联用仪。
氮吹：由于目标物黄曲霉毒素M1在免疫亲和柱里被富集后，必须使用纯甲醇或纯乙腈（2×1mL）洗脱时间不少于60s，才能洗脱下来。如果高效液相色谱质谱仪注入含黄曲霉毒素M1的样品，甲醇（或乙腈）含量超过10％，色谱峰变宽（也就是说黄曲霉毒素M1在液质或者液相中有很强的溶剂效应，无法准确定量）。如果水含量超过90％，则对色谱峰的形状没有影响；也就是说要通过氮吹来实现检测黄曲霉毒素M1目标物时溶剂转换过程。
实验方法：
（氮吹前峰面积）取不同品牌的黄曲霉毒素M1标准物质1000ng/mL(溶剂为纯甲醇)0.01mL，用10%甲醇稀释到1.0mL,进液质仪检测其相应的峰面积；
（氮吹后峰面积）：取不同品牌的黄曲霉毒素M1标准物质1000ng/mL(溶剂为纯甲醇)0.01mL于玻璃材质的收集管中，加2.0mL纯甲醇稀释（模拟样品富集后的洗脱条件：2×1mL纯甲醇洗脱），用和缓的氮气50℃下将其蒸发至近干后，改用10%甲醇定容，氮吹前后回收率比较见下表（回收率计算：氮吹后峰面积×100/氮吹前峰面积）。
为什么会想到要采用不同的黄曲霉毒素M1对其氮吹前后回收率比较呢？因为新的免疫柱使用前要进行柱回收率实验，采用B品牌的黄曲霉毒素M1对其进行柱回收率实验时，发现只有50%，远低于GB 5009.24-2016对其要达到80%回收率方可以使用的要求，难道是此次申购的免疫亲和柱？想到这个免疫亲和柱只是一个富集目标物的过程，没有什么实验步骤，于是按照回收率实验不理想的处理流程：将整个实验过程分步进行，且从最后一步的处理步骤反过来逐段排查回收率损失在哪个环节（分步检查），因此从最后一步“氮吹”开始排查，就发现此次使用的B品牌的黄曲霉毒素M1经过氮吹后只有50%的回收，更换不同的厂家（C品牌），同理进行氮吹回收率实验，也只有10%的回收，继续更换厂家（A品牌），终于此次的回收率可以达到98%以上了。
2.2收集管材质（聚丙烯与玻璃）氮吹峰面积比较
为什么不同品牌的黄曲霉毒素M1标准物质经氮吹后回收率的差距会这么大呢？决定对氮吹的过程进行优化：通常氮吹时使用的是玻璃试管,随着塑料制品在实验室的普遍应用,也有很多实验室使用聚丙烯塑料收集管用于氮吹, 本课程考察了不同材质试管对于氮吹的影响。分别对A品牌、B品牌、C品牌的黄曲霉毒素M1标准溶液进行比较分析：取6支玻璃试管和6支聚丙烯塑料试管加入不同品牌的黄曲霉毒素M1标准溶液(1000ng/mL)10μL, 加甲醇2mL稀释。用和缓的氮气50℃下将其蒸发至近干后。取出试管, 加10%甲醇水溶液1mL复溶, 涡旋2min, 转移至进样瓶中进样检测。氮吹前后回收率比较见下表。
从上表可以看出：使用聚丙烯材质的收集管对品牌B、品牌C氮吹后回收率的提高有一定的贡献，B品牌提高约12%，C品牌提高约20%，A品牌使用聚丙烯材质与玻璃材质收集管经氮吹后均符合GB 5009.24-2016对其回收率的要求（≥80%）；这可能是聚丙烯材质的收集管, 与有机物具有更强的亲和力, 不容易在氮吹的时候被吹走。在氮吹的时候,因此聚丙烯收集管相对玻璃收集管来说,是更好的选择。不过对于B、C品牌的黄曲霉毒素M1标准物质来说，其氮吹后的回收率还是没有达到 GB 5009.24-2016对其回收率的要求（≥80%），须继续查找原因。
2.3添加丙三醇后对黄曲霉毒素M1标准物质氮吹峰面积比较
通过查找相关的资料发现：丙三醇具有吸湿性, 可与醇类、胺类、酚类混溶, 与水互溶。常用作保湿剂，外观呈粘稠液态,且沸点较高（290.9 ℃）, 不易挥发；能够与水互溶。本课程根据其物理化学性质, 尝试将其作为氮吹时的添加剂, 以期改善黄曲霉毒素M1标准物质氮吹造成的回收率损失。另GB 5009.24-2016《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M族的测定》中, 要求在50℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干。近干, 是吹至在试管底部看不到明显的液体, 而在容器壁上仍然保留薄薄的一层液膜。但在实际实验操作中, 吹至近干较难操作, 如果没有及时取出试管, 这薄薄的一层液膜很快也被吹走, 近干将变成完全干掉。特别是批量样品一起氮吹时, 往往是待整批样品全部吹干后再取出试管, 而在这个过程中, 由于每一个样品吹干的速度不一致, 可能吹的比较快的试管已经吹干了, 而慢的试管仍有一些溶剂。因此导致吹干的比较快的试管中待测物质有所损失, 造成同一批次样品的回收率不一致。添加了丙三醇后，在甲醇挥干之后, 其仍然能保留在试管壁, 形成湿润的液膜层, 有效的防止了黄曲霉毒素M1被吹走, 消除了氮吹时黄曲霉毒素M1的损失。而丙三醇, 也并未对黄曲霉毒素M1的色谱分离及定量产生不良影响。因此尝试着将丙三醇加入黄曲霉毒素M1标准溶液的收集管中进行实验。
实验方法： 取36个聚丙烯塑料试管, 分成2组, 每组分别加入A品牌(6平行实验)、B品牌(6平行实验)、C品牌(6平行实验)的黄曲霉毒素标准溶液(1000ng/mL)10μL,加甲醇2mL稀释。其中一组不加丙三醇, 一组加入10%丙三醇溶液100μL,用和缓的氮气50℃下将其蒸发至干。全部吹干后, 取出试管, 加20%甲醇水溶液1mL复溶, 涡旋2min, 转移至进样瓶中进样。液质联用仪进样检测。
实验结果见下表及图。从图可以看出, 在氮吹时, 加入100μL丙三醇溶液时, 可以明显提高黄曲霉毒素M1的回收率。回收率已接近100%。
黄曲霉毒素M1的检测流程图
黄曲霉毒素M1的SPE图
3 黄曲霉毒素M1的能力验证
参加能力验证，是每个实验室的基本要求。因此再参加能力验证之前，最好准备两、三个不同厂家的标准物质，如果条件不允许，标准物质在申购时，难免会更换成不同的品牌，因此在检测时，如果基质加标实验发现：基质回收率只有50%或者更低，标准品过免疫亲和柱回收也只有50%或者更低，购买的质控样的结果又接近质控样的指定值，此时能力验证的样品是否要折算回收率呢？其实在遇到能力验证的阳性样品时，其样品里添加的黄曲霉毒素M1与我们做加标回收时所添加黄曲霉毒素M1的标准物质不是同一来源，因此不能盲目怀疑是整个实验过程就会造成回收率不理想而对样品的测定结果进行回收率折算（如按GB 5009.24-2016正常氮吹会造成B、C品牌的回收率只有40%，10%，但是对A品牌的回收率就没有影响：接近100%）；同时也很好地解答了以下版友的困惑： https://bbs.instrument.com.cn/topic/7625402_3?order=threadid
有版友也遇到黄曲霉毒素M1标准物质通过样品的加标回收后发现回收率只有50%，而忽略了氮吹对不同品牌黄曲霉毒素M1标准物质的影响，就对样品的含量进行折算，从而使得自己没有顺利通过此次的能力验证。
总结：
本文主要讲述了依据GB 5009.24-2016标准检测黄曲霉毒素M1时的检测要点：1、黄曲霉毒素M1时免疫亲和柱使用的注意事项；2、氮吹对黄曲霉毒素M1标准物质的影响；3、优化氮吹的方式：（1）将氮吹收集管由玻璃材质的更换为聚丙烯材质，聚丙烯材质的对其提高回收率有一定的贡献，这可能是聚丙烯材质的收集管, 与有机物具有更强的亲和力, 不容易在氮吹的时候被吹走，因此聚丙烯收集管相对玻璃收集管来说,是更好的选择；（2）添加丙三醇作为氮吹时的添加剂，可以满足GB 5009.24-2016的标准，且可以减轻氮吹对近干的要求。
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