tianru的爸爸
第2楼2006/07/06
亲和色谱的基本原理
亲和色谱(affinity chromatography)与其它类型的色谱技术有所不同,它是在一种特制的具有专一性吸附能力的吸附剂上进行的色谱。
利用亲和色谱技术分离某一生物分子时,首先必须寻找能够被该分子识别和可逆结合的生物专一性物质,此物质称为配基(ligand)(如酶、辅酶、抗体、激素等)。其次要把该配基以共价键结合到色谱介质(不溶性固体基质,也就是固定相)上,此色谱介质称为载体(carrier)。最后把固定化配基充填在色谱柱内做亲和柱,使要分离的混合物流经该亲和柱,混合物中只有能与配基专一性结合形成络合物的分子被吸附,不能被结合的杂质则直接流出,通过更换洗脱液的方法,促使被吸附物从配基上解吸下柱,从而获得亲合物。亲和色谱主要用于蛋白质和生物活性物质的分离与制备。
tianru的爸爸
第4楼2006/07/06
应用实例:2-胰凝乳蛋白酶的提纯
1、亲和吸附剂(Σ-氨基-N-乙酰-D-色氨酸)的制备:取一定体积的Sepharose4B,加入100mgCNBr。搅拌混合物,滴加2-8mol/L NaOH,使溶液pH维持在11.0。在20℃左右,8-12分钟完成反应。在布氏漏斗中抽滤活化的琼脂糖,然后用20倍体积冷的0.1mol/L NaHCO3(pH9.0)溶液洗涤。将上述活化的Sepharose4B与等体积0.1mol/L NaHCO3(pH9.0并在冰箱中预冷)溶液混合,接着迅速加入α-胰蛋白酶抑制剂(Σ-氨基-N-乙酰-色氨酸甲酯)。抑制剂的最大用量为每毫升Sepharose 4B 65μmol/L。4℃缓慢搅拌约24小时,而后再用水和缓冲液反复地洗至没有游离的抑制剂为止。制得的亲和吸附剂在50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中保存备用。
2、分离:亲和吸附剂装柱后用50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液平衡(室温)。样品溶于同样缓冲液中并上柱,再应用同样缓冲液淋洗柱子。流速为30-60ml/小时,直至280nm无光吸收时停止洗涤,然后改用0.2mol/L醋酸缓冲液(pH3.0)洗脱。
再上传一个别人的文献。免疫亲和层析法纯化重组人促红细胞生成素的实验研究