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峰面积波动（液相）

遗忘曲线

2021/08/10

液相色谱（LC）

同一样品多次注入时，峰面积波动的原因是什么

有许多不同的原因。HPLC仪器的每个部分都可以导致峰面积的变化。让我们一一检查。

首先想到进样器。您可能遇到的问题在某种程度上取决于进样器的类型。但是在所有情况下，在测量进样体积期间气泡的形成是主要的问题来源。如果您是手动进样，请确保注射器中没有气泡。使用固定回路进样器时，确保没有空气进入进样器环路。在自动进样器中，如果样品瓶的盖子密封在针头周围则会形成气泡，当注入大部分样品时会产生真空。任何气泡的形成都会导致每次进样之间进样量的差异。

果样品之间分析物的浓度差异很大，并且从单个样品获得的峰面积仅在两次或三次进样后才保持恒定，样品残留可能是问题的根源。每次注射后（如果您是手动注射）请仔细清洗注射器，或在自动进样器中检查针头清洗。确保用于针头清洗的溶剂是分析物的良好溶剂。

每次运行时峰面积的减少也可能是由于温度变化引起的，但是影响很小，不到2％。如果将样品从冰箱中取出并放入自动进样盘中，它将缓慢升温至进样器温度，并且溶剂会膨胀。因此，当样品达到样品盘的温度时，您开始时注入的样品体积比随后的大。

流速的随机变化也会导致峰面积波动。它们通常是由止回阀故障或泵头中的空气或气蚀引起的。它们通常还伴随着保留时间的波动。您可以通过监控背压来检查这是否是问题所在。可以容忍的波动取决于峰的宽度。假设您的泵的两个扬程之间的流量差为10％。如果您的峰宽约为20个泵冲程，则由泵的脉动引起的峰面积波动小于1％。但是，如果峰值宽度约为一个泵冲程，则它将为10％。

流速变化的另一个潜在原因是系统高压侧泄漏。应该很容易找到。

积分错误更难以解决。通过简单的目测即可发现软件积分峰的方式的重大变化，但很难发现更细微的变化。信噪比为100或更低时，拖尾峰经常会产生明显的积分误差。通常，基线噪声限制了积分的精度，但是随着峰前延或峰拖尾的出现，问题变得更加严重。您可以尝试设置不同的积分参数重新处理数据，然后查看是否可以解决问题。

在复杂的样品中，其峰仅能从目标峰中略微分辨出来，因此该软件可能很难确定基线在哪里。在这种情况下，使用强制基线进行手动积分或自动积分可以提高积分的可重复性。

样本本身可能是问题的根源。在反相色谱中，已经观察到某些蛋白质在初始梯度过程中不会完全洗脱。在随后的空白梯度中洗脱额外的量。这种“鬼峰”特定于蛋白质和洗脱方案。如果发生这种情况，则需要在两次分析之间运行空白梯度。

同样，蛋白质可以“不可逆地”吸附在某些色谱柱上。全新色谱柱获得的峰面积可能随着重复进样而缓慢增加。据推测，某些蛋白质会与包装上的活性位点结合。这些地点一旦饱和，获得了可重现的峰面积。不必使用您需要分析的蛋白质。据报道，也可以使用其他蛋白质来饱和活性位点。

检测器间接地导致峰面积波动。峰的积分程度取决于其信噪比。您不能期望峰面积的重现性比基线噪声与最大峰值处的信号的比率更好。流动相很少是峰面积波动的原因。如果流动相组成发生任何变化，那么它们将影响保留时间，而影响峰面积的时间要早得多。流动相可能产生的鬼峰或负峰同样影响积分。通常可以通过将样品溶解在流动相中来避免这种情况。

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