韭菜与芹菜中农残能力验证经验分享
鹤壁市农产品检验检测中心 张艳丽
9月份接到上级部门通知，要进行蔬菜中农残能力验证的考核，此次考核不同往年，基质是较为复杂的韭菜与芹菜，所以整个考核的难度增加，考核农药为22种，需要用到气相色谱仪、气质联用仪、液质联用仪等大型仪器，能不能一个前处理方法，三台不同仪器都能检测？如果不同仪器出的数据不同，该怎么办？这些问题本次能力验证都遇见过，总结了一下分享给大家。
一、考核项目
本次能力验证考核共发放A和B两组样品，A样品的基质为芹菜，B样品的基质为韭菜。考核项目范围：甲胺磷、毒死蜱、甲拌磷、三唑磷、对硫磷、异菌脲、虫螨腈、三唑酮、腐霉利、 氯氰菊酯、 联苯菊酯、 氯氟氰菊酯、氰戊菊酯、噻虫嗪、 噻虫胺、啶虫脒、多菌灵、克百威 、吡虫啉、烯酰吗啉、嘧霉胺、吡唑醚菌酯。
图1：考核样品与配好的标液。
二、前处理过程
每个单位发放6个样品，其中4个为考核样品，2个为干扰样品，没有空白样品。考核样品质量为25.00g，须一次性全部转移提取。
检测方法有NY/T 761-2008气相色谱法、GB23200.121-2021液相色谱-串联质谱法、GB 23200.113-2018 气相色谱-质谱法。
样品量只有25.0g，如果做不同的3个前处理，样品量是不够的。所以提取方法是一样，净化方法分开，一个用NY/T761方法，上气相色谱仪检测，一个用GB23200.121方法，上气质联用仪与液质联用仪检测。
1.提取
将25.0g菜样，加50.00mL乙腈，要分次清洗塑料离心管，转移至广口瓶中，在匀浆机中高速匀浆2min后用滤纸过滤，滤液收集到装有5g∽7g氯化钠的100mL具塞量筒中，收集滤液40mL∽50mL，盖上塞子，剧烈1震荡min，在室温下静置30min，使乙腈相与水相分层。
图2：提取过程
2.净化
2.1 NY761-2008方法：
从100mL具塞量筒中吸取10.00mL乙腈溶液，放人150mL烧杯中，将烧杯放在80℃水浴锅上加热，杯内缓缓通入氮气或空气流，蒸发近干，加人2.0mL丙酮，盖上铝箔，备用。
将上述备用液完全转移至15mL刻度离心管中，再用约3mL丙酮分三次冲洗烧杯，并转移至离心管，最后定容至5.0mL，在旋涡混合器上混匀，分别移入两个2mL自动进样器样品瓶中，供色谱测定。
图3：有机磷净化过程
从100mL具塞量筒中吸取10.00mL乙腈溶液，放人150mL烧杯中，将烧杯放在80℃水浴锅上加热，杯内缓缓通人氮气或空气流，蒸发近干，加入2.0mL正己烷，盖上铝箔，待净化。
将弗罗里矽柱依次用5.0mL丙酮十正己烷（10+90）、5.0mL正已烷预淋洗，条件化，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，立即倒入上述待净化溶液，用15mL刻度离心管接收洗脱液，用5mL丙酮+正己烷（10十90）冲洗烧杯后淋洗弗罗里矽柱，并重复一次。将盛有淋洗液的离心管置于氮吹仪上，在水浴温度50℃条件下，氮吹蒸发至小于5mL，用正己烷定容至5.0mL，在旋涡混合器上混匀，分别移人2mL自动进样器样品瓶中，待测。
图4：有机氯净化过程
2.2 GB23200.121-2021方法
从100mL具塞量筒中吸取6.0mL上清液，至PSA 400mg，C18 400mg，MgSO4 1.2g的净化管中，涡旋混匀1min，4200r/min离心5min，吸取上清液过0.22μm滤膜，分别上气相色谱仪、气质联用仪、液质联用仪等测定。
图5：GB23200.121方法的净化过程
三、仪器条件
1.气相色谱仪条件
1.1仪器
gc450气相色谱仪（天美公司），gc7890B气相色谱仪（美国安捷伦公司），都有PFPD、ECD检测器。
1.2色谱条件
1.2.1有机磷检测条件
色谱柱：VF-1701MS（30m×0.25mm×0.25um）；温度：80℃保持1min，以20℃速度上升到130℃，再以5℃上升到200℃，再以15℃上升到250℃，保持11min。进样体积：1uL；进样口：250℃，不分流进样；检测器300℃；进样口温度：250℃；氮气流速：30mL/min；柱流速：2mL/min；空气流速：17mL/min；氢气流速14mL/min。
1.2.2有机氯的检测条件
色谱柱：DB-5（30m×0.25mm×0.25um）温度：150℃保持1min，以15℃速度上升到280℃,保持10.00min。进样体积：1uL；进样口：250℃，不分流进样；检测器300℃；进样口温度：250℃，氮气流速：30mL/min；柱流速：2mL/min。
2.气质联用仪条件
2.1仪器
安捷伦气质联用仪7000D，配有电子轰击源EI。
2.2色谱条件
色谱柱：HP-5石英毛细管柱；30m×0.25mm×0.25um，或相当者。
程度升温：40℃保持1min，然后以40℃/min程序升温至120℃，再以5℃/min升温至240℃，再以12℃/min升温至300℃，保持6min；载气：氦气，纯度≥99.999%，流速1.0mL/min；进样口温度：280℃；进样量：1L；进样方式：不分流进样。
2.3质谱条件
电子轰击源：70cV；离子源温度：280℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟：3min；MRM扫描方式。
3.液质联用仪条件
3.1仪器
AB Sciex4500高效液相色谱-串联质谱仪（配有电喷雾电离（ESI）源，美国AB SCIEX公司）。
3.2色谱条件
色谱柱：Altantis T3柱（50mm×2.1mm，3.0um）；柱温：40℃；流动相：A相为水（含0.01%甲酸（v/v)和1mM/L甲酸铵），B相为纯甲醇。
梯度洗脱程序：0~2.0min，90%A；5.0~12min，5%A；12.1~13min，90%A；流速：0.4mL/min；进样量：1uL。
图6：流动相梯度
3.3质谱条件
离子源：ESI；扫描方式：正离子扫描；扫描方式：多反应监测（MRM）模式；电喷雾电压：5500V；雾化气压力：50psi；气帘气压力：30psi；辅助加热气：60psi；离子源温度：400℃；碰撞气压力：9psi。
虫螨腈用负离子模式，扫描方式：多反应监测（MRM）模式；电喷雾电压：-4500V；雾化气压力：70psi；气帘气压力：30psi；辅助加热气：70psi；离子源温度：620℃；碰撞气压力：9psi。
图7：质谱条件
四、标准溶液配制
从市场上购买芹菜、韭菜，分别按NY761-2008方法、GB23200.121-2021进行前处理，得到基质。
图8：芹菜与韭菜前处理后得到的基质
甲胺磷、毒死蜱、甲拌磷、三唑磷、对硫磷、异菌脲、三唑酮、腐霉利、 氯氰菊酯、 联苯菊酯、 氯氟氰菊酯、氰戊菊酯等标液，用芹菜、韭菜基质配成0.1ug/mL、0.2ug/mL混标,分别用气质联用仪、液质联用仪进行绘制标液模板。
图9：气质联用仪的直线
虫螨腈、噻虫嗪、 噻虫胺、啶虫脒、多菌灵、克百威 、吡虫啉、烯酰吗啉、嘧霉胺、吡唑醚菌酯等标液，用芹菜、韭菜基质配成0.005ug/mL、0.01ug/mL、0.02ug/mL、0.05ug/mL、0.10ug/mL、0.20ug/mL。标准曲线的线性都在0.9995以上。
图10：液质联用仪的5个浓度点直线
五、数据结果
6个考核样品经过以上前处理后分别上3台仪器进行检测，情况如下：
1.气相色谱仪数据
用NY761-2008前处理方法处理后的样品，上两台气相色谱仪进行测定，发现杂峰较多，数据受干扰较大，无法得出结果。
图11：芹菜与韭菜在气相色谱仪上的色谱图
2.气质联用仪数据
用GB23200.121-2021前处理方法处理后的样品，上气质联用仪测定，初步判断芹菜中含有毒死蜱、腐霉利、 氯氰菊酯等3种农药，浓度为0.40mg/kg、0.30mg/kg、0.10mg/kg左右，韭菜中含有毒死蜱、异菌脲、氯氰菊酯等3种农药，浓度分别为浓度为0.30mg/kg、0.40mg/kg、0.10mg/kg左右。这6个样品的浓度稍有差异。
3.液质联用仪数据
用GB23200.121-2021前处理方法处理后的样品，上液质联用仪测定，初步判断芹菜中含有毒死蜱、腐霉利、 氯氰菊酯等3种农药，浓度为0.40mg/kg、0.35mg/kg、0.090mg/kg左右，韭菜中含有毒死蜱、异菌脲、氯氰菊酯、多菌灵等4种农药，浓度分别为浓度为0.35mg/kg、0.40mg/kg、0.080mg/kg、0.070mg/kg左右。这6个样品的浓度稍有差异。
4.质控样品
根据以上数据结果，做加标回收的质控样品，市场购买芹菜与韭菜样品，用水浸泡与清洗，破碎后进行与考核样品一样的前处理，称样后加入标液，加标量为芹菜中毒死蜱0.40mg/kg、腐霉利0.40mg/kg、氯氰菊酯0.10mg/kg,韭菜中毒死蜱0.30mg/kg、异菌脲0.40mg/kg、氯氰菊酯0.10mg/kg、多菌灵0.10mg/kg等。加标回收率为89%-103%，符合标准要求。
配的标液与加标量一样，都用单点校正。
图12：气质联用仪的加标回收与考核样品结果
图13：液质联用仪的加标回收与考核样品结果
六、数据上报
配制与加标量一样的标液浓度，同时计算加标样品与考核样品，得出的数据上报，数据进行数字修约，保留三位有效数字。同时附原始记录、图谱、质控样品等。
七、总结
本次能力验证样品量有限，如果用不同的前处理方法，样品量不够，农药种类多，所用的仪器较多，得出的数据不相同，如何解决呢？
1.选择合适的前处理方法
拿到样品后，先选择前处理方法，如果选择NY761-2008方法，步骤较多，耗费时间较长，而且这样的前处理方法用气质联用仪、液质联用仪等质谱仪检测，是否合适，没做过试验，无法得出结论。如果选择GB23200.121-2021方法，适合用质谱仪，但不是气相色谱法，数据受影响。权衡两个方法的优缺点，提取用NY761-2008方法，净化用GB23200.121-2021方法。
2.选择合适的仪器
考核样品用NY761-2008方法处理完，上气相色谱仪检测时，发现根本无法定性，因为韭菜芹菜都属于基质复杂的样品，干扰较大，气相色谱仪不具备扣除干扰的功能，所以选择气质联用仪与液质联用仪来检测。
3.计算出现问题
通过配的单标与标准曲线估算出相应的数据，进行了相应浓度的加标试验，发现加标回收率全部只有50%，检查计算公式，才知最后结果乘2才行。这是因为NY761-2008的计算公式是分子分母相约后为1,色谱图上得出的数据就是最终数据，而GB23200.121-2021公式分子分母相约后为2，色谱图上的数据要乘2才是最终数据。
图14：计算公式
4.数据不同
在能力验证过程中，会做多次试验，用多台仪器，这样会得到多个数据结果，哪个数据是准确的？
4.1基质不同造成数据不同
用基质配标液很重要，对气质联用仪来说，可以减少基质增强效应，减少衬管的吸附，对液质联用仪来说，可以减少基质抑制效应，一定要选择与考核样品相同前处理方法得到的基质溶液，此次用NY761-2008方法处理后的基质配的标液，与用GB23200.121-2021方法处理后的基质配的标液，去计算同一个样品，结果相差较大。所以一定要用与考核样品一样的前处理得到的基质配标液，去计算样品含量，才是最准确的。
4.2仪器不同造成数据不同
气质联用仪检测得出一批数据，液质联用仪得出一批数据，这两批数据会有相同，会有不同，采用哪个数据，还是要看质控样品。质控样品的加标回收率起决定作用，比如毒死蜱的加标回收率在气质联用仪上是103%，而同一样品在液质联用仪上的加标回收率是98%，那么考核样品的结果以液质联用仪为准，同理，氯氰菊酯的加标回收率在液质联用仪上为90%，而在气质联用仪上的回收率为100%，那么考核样品的结果以气质联用仪为准。
5.回收率折算
在质控样品的回收率在80%-110%期间时，直接上报考核样品的数据结果，不要进行回收率折算，折算后数据可能会通不过。加标回收率在正常范围内，说明整个前处理过程与仪器条件是正常的，可以相信最后的数据结果。
6.准备工作要充分
拿到能力验证的通知，一定要先准备相同的基质样品，比如考核样品为韭菜与芹菜，要先购买韭菜与芹菜，进行相应的前处理，进行加标回收练习，看看哪个环节出问题。即使准备工作很充分，还会有很多变数，比如考核样品量少，前处理要进行优化，这些在考核前要考虑到，做到随机应变，应对自如。
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