mingxiaoyan
第1楼2022/05/25
普通 PCR 仪或作为普通 PCR 仪使用的其他类型 PCR 仪需要校准的主要是与温度相关 的计量特性，温度的准确性、均匀性、稳定性等对 PCR 仪的检测结果有直接的影响。 JJF1527-2015《聚合酶链反应分析仪校准规范》给出的 PCR 仪的计量特性主要有以下 6 个:
(1)温度示值误差(temperature indication error)在温度技术指标校准程序中，调控装 置(如加热模块)的设定温度值与测量点实际测量的温度平均值之差。
(2)温度均匀度(temperature uniformity)同一循环中，温控装置(如加热模块)内不 同孔之间的实测最高温度与最低温度之差。
(3)平均升温速率(mean heating rate)在温度技术指标校准程序中，实时荧光定量 PCR 仪模块升温过程中，平均单位时间上升的温度值。
(4)平均降温速率(mean cooling rate)在温度技术指标校准程序中，实时荧光定量 PCR 仪模块降温过程中，平均单位时间下降的温度值。
(5)样本示值误差(sample indication error)PCR 仪的测量结果的平均值与标准物质的 标称值之差。
(6)样本线性(sample linear)以系列稀释的标准物质(至少 5 个)扩增 Ct 值与浓度 对数值进行线性回归，计算其线性回归系数 r。
mingxiaoyan
第2楼2022/05/25
PCR 实战宝典 No.10：PCR仪校准溯源
仪器信息网
一生不羁放纵爱仪器
来自专栏科学仪器实战宝典：PCR篇
PCR 实验数据结果对临床检验、检验检疫、法医鉴定、疾病控制、体外诊断试剂制造 和研发、生物技术产品研发等领域的研究和确证工作非常重要，而对 PCR 仪有效的量值溯 源和准确性验证，是确保 PCR 实验数据可靠和结果准确的基础。因此，做好 PCR 仪的校准、 期间核查、维护保养等质量控制工作，确保 PCR 仪性能持续良好，对分子生物学的研究， 特别是保证相关领域确证类数据结果的准确可靠，从而确保国家公共卫生和广大人民群众生 命安全方面，具有非常重要的意义。
随着酶学、光学和自动化技术的发展，PCR 技术实现了从定性到定量再到数字化定量 的发展，从普通 PCR 到实时荧光定量 PCR，再到数字 PCR，PCR 技术特异性越来越强，自 动化程度越来越高。但综合来看，荧光定量 PCR 仍然是目前各类检验检测机构使用最广泛 的基因检测和定量技术。以新冠病毒核酸检测工作为例，在国家卫健委发布的《新型冠状病 毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》中，将实时荧光定量 PCR 列为确诊病例的两种方法 之一，由于检测时间短、成本低等特点，荧光定量 PCR 成为应用最广的确诊新型冠状病毒 的方法，在新冠病毒核酸检测中发挥了不可替代的重要作用。
本章在介绍各种类型 PCR 仪的同时，主要以荧光定量 PCR 仪为重点，提供检验检测机 构开展 PCR 仪的校准、期间核查以及日常的维护保养工作的指南，并附以相应实例，为检 验检测机构更好地开展相关质量控制工作提供参考。
第一节 PCR仪计量特性
计量特性是指能影响测量结果的可区分的特性，PCR 仪的计量特性包括与温度、时间和荧光信号强度等参数有关的特性。
(一)PCR 仪的计量依据
对普通 PCR 仪来说，温度校准业务的需求十几年前就有，但是当时并没有统一的校准 规范来确定 PCR 仪温度校准这部分具体需要校准哪些项目，校准用标准器又必须达到哪些 要求，所以当时的各校准机构主要根据客户要求来确定校准的方式方法，每家机构的校准方 法都不尽相同。
2015 年原国家质量监督检验检疫总局发布并实施了 JJF1527-2015《聚合酶链反应分析仪校 准规范》，该规范的实施给 PCR 仪的校准工作提供了指导方法，不仅规定了 PCR 仪温度部 分需要校准的项目有哪些，还指明了项目的具体校准方法。但 JJF1527-2015《聚合酶链反应 分析仪校准规范》仅适用于模块加热的 PCR 仪计量性能的校准，随着 PCR 技术和类型的快 速发展，该规范只能针对荧光定量 PCR 或数字 PCR 平台中独立的 PCR 仪的温度控制系统 进行校准，显示出一定的局限性。
由于荧光定量 PCR 仪在普通 PCR 仪的技术上增加了荧光激发装置和检测系统，包含激 发光光源、滤光片、镜头和荧光检测器等，因此，温度与光学系统共同对荧光定量 PCR 仪 的性能起到决定性控制作用，共同决定最终实验结果的准确性和可靠性。对荧光定量 PCR 仪的校准需求也逐步从单纯的温场校准转向温度加荧光的复合参数校准。
目前，可以参考的实时荧光定量 PCR 仪的校准标准主要有 JJF(津)04-2020《实时荧 光定量 PCR 仪校准规范》和 JJF(苏)222-2019《实时荧光定量 PCR 仪校准规范》
随着数字 PCR 技术的不断发展，Bio-Rad、LIFE Technologies 及 Rain Dance 等厂家相继 推出技术较为成熟的数字 PCR 产品，针对数字 PCR 仪校准规范的空白，据悉由全国生物计 量技术委员会对口负责的《数字 PCR 仪校准规范》征求意见稿已经起草完成，并面向全社 会公开征求意见。
除以上标准，可参考的其他计量依据还有 JJF1821-2020《聚合酶链反应分析仪温度校准 装置校准规范》，规范中对 PCR 仪温度校准所使用的标准器做出指引，同时对标准器的量值 溯源给出了具体方法。
(二)不同类型 PCR 仪的计量特性
1. 普通 PCR 仪或作为普通 PCR 仪使用的其他类型 PCR 仪的计量特性
普通 PCR 仪或作为普通 PCR 仪使用的其他类型 PCR 仪需要校准的主要是与温度相关 的计量特性，温度的准确性、均匀性、稳定性等对 PCR 仪的检测结果有直接的影响。 JJF1527-2015《聚合酶链反应分析仪校准规范》给出的 PCR 仪的计量特性主要有以下 6 个:
(1)温度示值误差(temperature indication error)在温度技术指标校准程序中，调控装 置(如加热模块)的设定温度值与测量点实际测量的温度平均值之差。
(2)温度均匀度(temperature uniformity)同一循环中，温控装置(如加热模块)内不 同孔之间的实测最高温度与最低温度之差。
(3)平均升温速率(mean heating rate)在温度技术指标校准程序中，实时荧光定量 PCR 仪模块升温过程中，平均单位时间上升的温度值。
(4)平均降温速率(mean cooling rate)在温度技术指标校准程序中，实时荧光定量 PCR 仪模块降温过程中，平均单位时间下降的温度值。
(5)样本示值误差(sample indication error)PCR 仪的测量结果的平均值与标准物质的 标称值之差。
(6)样本线性(sample linear)以系列稀释的标准物质(至少 5 个)扩增 Ct 值与浓度 对数值进行线性回归，计算其线性回归系数 r。
表 10.1 参照 JJF1527-2015《聚合酶链反应分析仪校准规范》的 PCR 仪计量特性
2. 荧光定量 PCR 仪的计量特性
荧光定量 PCR 仪的计量特性除了有温度相关计量特性，还有光学计量特性，如:
(1)阈值循环数(threshold cycle):均热块测量孔内的荧光信号到达指数扩增时经历 的循环周期数。主要的计算方式是以扩增过程前 3 到 15 个循环的荧光值的 10 倍标准差为阈 值，当荧光值超过阈值时的循环数则为阈值循环数。
(2)阈值循环数精密度(precision of threshold cycle):均热块测量孔在同一荧光条件下阈值循环数重复测量的一致性。
(3)熔解温度漂移(melt temperature bias):实时荧光 PCR 仪校准时，根据熔解曲线计算的熔解温度值与光学模拟器熔解温度设定值之差。
(4)通道峰值强度一致性(channel peak intensity consistency, CPHC):熔解曲线上，所有采样测量孔峰值强度的变化趋势。
(5)线性灵敏系数(linear sensitivity factor, LSF):同一熔解温度下，表征熔解曲线线性变化灵敏程度的比率。
(6)熔解温度比(ratio of melt temperature, RTm):同一熔解温度下，表征熔解温度漂移因素的比率。
(7)荧光强度精密度(precision of fluorescence intensity):均热块测量孔在同一荧光条件下荧光强度重复测量值的一致性。
数字 PCR 系统的扩增过程包括样品分散、样品热循环和样品检测，仅仅对独立的温控 系统进行校准无法反映仪器的真实性能。鉴于数字 PCR 仪的国家产品标准和校准规范还尚 未发布，国外也未发布相应的国际标准，目前国内外多数计量机构按照机构内部确认的方法 对数字 PCR 仪进行校准。据了解，国内计量机构有选取温度示值误差、温度均一性、升降 温速率、拷贝数示值误差、拷贝数重复性、微滴荧光强度重复性和微滴个数重复性作为性能指标进行校准评定。Bio-Rad 在对微滴式数字 PCR 仪开展 3Q 确认时，分别进行光路校准和液路验证，对分离室的个数、荧光强度、荧光强度变异性等参数进行确认。
JOE HUI
第4楼2022/05/25
应助达人楼主，你找的第三方校准不了不代表其它机构不具备资质，像广州计量院等就具备该项目校准资质，可以出具带CNAS标识的校准报告，只有校准后符合要求才能正常测试出具相关检测结果和报告，
对于核酸提取仪和聚合酶链反应分析仪（PCR）是核酸检测过程的核心设备。核酸提取仪是采用磁珠法或离心柱法分离技术，从血液、组织、体细胞中分离纯化高纯的核酸，校准依据是JJF 1874-2020《(自动)核酸提取仪校准规范》，主要校准项目包括：温度示值误差、均匀性和稳定性，振动频率示值误差和稳定性、核酸提取回收率一致性、重复性等。
聚合酶链反应分析仪（PCR）的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。PCR仪校准依据是JJF 1527-2015《聚合酶链反应分析仪校准规范》，主要校准项目包括：温度示值误差和均匀性、升降温速率、样本示值误差和线性等。
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